摘要
背景 蛋白质棕榈酰化修饰作为一种动态可逆的蛋白质翻译后修饰方式，广泛存在于中枢神经系统中，对神经网络活动和突触信号传递过程起到极其重要的调控作用。蛋白质棕榈酰化是细胞内唯一可逆的16碳脂肪酸的修饰反应。目前研究证实人体中有23个酶负责蛋白质的棕榈酰化修饰，然而蛋白质的去棕榈酰化作用却只有4个酶参与，棕榈酰蛋白硫脂酶-1(Palmitoylproteinthioesterase-1，PPT1)便是其中之一。PPT1酶活力缺失会导致非常严重的神经退行性疾病，临床上称为婴幼儿神经元蜡样脂褐质综合征(infantileneuronalceroidlipofuscinosis，INCL)，是Batten病之一。这是一种常染色体隐性神经退行性疾病，特征是癫痫发作、失明、运动和认知功能减退，最终导致早逝。INCL疾病是位于常染色体1p34.2座位上的CLN1基因突变引起的棕榈酸酯蛋白质硫酯酶-1功能缺乏，导致蛋白质去棕榈酰化过程受阻。 虽然普遍认为PPT1酶介导的去棕榈酰化修饰作用在介导神经突触可塑性和大脑学习记忆过程中起到重要，但是其作用的具体调控机制尚不十分清楚。本课题组通过点突变方式成功建立了PPT1酶的缺失动物模型(PPT1c.451C＞T(p.R151X)，简称PPT1-KI)，该模型可以显著地模拟INCL这种疾病的各种临床病理表现。所以在此基础之上本课题利用电生理?分子生物和动物行为学实验技术进一步探讨了PPT1酶活力缺失情况下，棕榈酰蛋白质和膜受体的棕榈酰化修饰作用如何参与神经突触传导和其可塑性的功能机制，试图阐明PPT1酶介导突触可塑性和动物个体行为方面的分子机制。 目的 本研究以PPT1缺失(c.451C＞T，PPT1-KI)小鼠模型为基础，探讨PPT1缺失引起突触调节蛋白去棕榈酰化过程受阻对突触形态和功能可塑性方面的影响，进一步阐明其调控神经可塑性和学习记忆的可能机制。 方法 ①通过行为学实验(新物体识别方法)来整体评价PPT1酶缺失对小鼠短期工作记忆的影响；②电生理的诱导长时程增强(long-termpotentiation,LTP)、长时程抑制(long-termdepression,LTD)、Stimulus-ResponseCurve和双脉冲易化，探讨PPT1参与突触长期/短期可塑性形成机制；③在原代海马神经元培养基础上通过转染和全细胞膜片钳记录的方式评价PPT1在介导神经电活动中作用方式；④用分子生物学Westernblotting方法检测突触可塑性相关调控蛋白(GAD65，SYT2，SNAP25，VGCC，PSD95，AMPA受体，NMDA2A和2B受体，钙调素)的表达水平变化，具体阐明相关的分子调控机制。 结果 1.PPT1缺失抑制了小鼠大脑海马CA1区的LTP和LTD的形成。 2.PPT1缺失对小鼠海马神经元突触的递质传递造成了损伤，并随着年龄的增损伤会加剧。 3.PPT1缺失导致大脑海马神经元细胞树突棘形态异常，树突棘密度、体积和神经元复杂程度降低，树突棘发生异常聚集。 4.PPT1缺失会引起海马神经元兴奋性兴奋性突触电流异常兴奋，兴奋性突触传递异常。 5.PPT1酶缺失抑制突触前神经递质的释放。 6.PPT1缺失会导致突触前膜囊泡数量减少，使囊泡循环能力下降。 7.PPT1缺失在早期会导致神经元突触后膜上PSD95和NMDA2B相关功能调控蛋白和受体的亚细胞分布异常。 8.PPT1缺失发展到晚期时GAD65，SYT2，SNAP25，VGCC，PSD95，NMDA2A和2B受体，钙调素均发生明显下调。其中，SYT2和VGCC和CaMKII是参与突触前囊泡释放回收的蛋白，所以说INCL这种疾病在晚期可能突触前/后均出现问题，在晚期PPT1缺失会导致神经元突触前膜与后膜上相关功能调控蛋白和受体的亚细胞分布异常。 结论 PPT1缺失引起的蛋白质去棕榈酰化修饰受阻导致突触相关功能性受体的亚细胞分布异常，从而减弱神经元突触可塑性，最终损害模型动物的学习与记忆功能。
NETL