脐带血CD34阳性细胞在体外分化为巨核细胞和功能性血小板的研究

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中文摘要：血小板是由骨髓中的多核巨核细胞释放出来的直径2-3μm的无核细胞碎片，其参与人体内的凝血与止血反应，因而具有重要的生理作用。但是由于血小板数量少，在体外仅能保存5-7天，因此需要在体外不断生产血小板来满足临床的需要。本文旨在建立将脐带血中分离提取的CD34阳性细胞在体外分化为功能性血小板的方法。目的：建立将脐带血中CD34阳性细胞在体外分化为巨核细胞及血小板的方法，提高巨核细胞及血小板的生成比例及数量，并验证血小板的体内外功能。研究方法：对从脐血CD34阳性细胞分化为血小板的方法进行优化，在分化的不同阶段使用不同的培养基和细胞因子组合。分化过程分为三个阶段：1.CD34阳性细胞分化为早期巨核细胞；2.早期巨核细胞分化形成成熟巨核细胞；3.成熟巨核细胞生产血小板。使用SFEMⅡ培养基或SFM培养基和细胞因子SCF、TPO、IL3、IL6、IL11的组合提高从脐血CD34阳性细胞产生巨核细胞和血小板的数量和比例；使用瑞士-吉姆萨染色法，鉴定早期巨核细胞、成熟巨核细胞及血小板的形态特征。RT-PCR检测CD34阳性细胞向巨核细胞和血小板分化过程中的特征基因及转录因子表达量的变化。并通过转录组测序，分析不同分化阶段中巨核细胞的基因表达水平。通过免疫荧光染色，鉴定巨核细胞和血小板是否表达血小板参与体内凝血功能的重要分子CD62P。用ADP激活血小板后，流式细胞仪检测血小板与PAC1的结合能力。建立血小板减少的小鼠模型，并通过尾静脉向小鼠注射的人血小板样品和分化产生的血小板，分时间点用流式细胞仪检测小鼠血液中的人血小板的比例变化，并检测小鼠的凝血时间与出血时间。研究结果：（1）经过优化后的CD34阳性细胞分化方法，通过流式检测与瑞氏-吉姆萨染色证实，在体外可以得到90%的CD41a+早期巨核细胞和85%以上的CD41a+CD42a+成熟巨核细胞，分化出CD42b+CD62P+血小板的纯度达到75%以上。（2）RT-PCR和转录组测序分析结果表明：巨核细胞和血小板相关的细胞标志基因CD41、CD42a、CD42b、CD61的表达量随分化天数的增加而升高；随着成熟巨核细胞向血小板分化，RUNX1、FLI1、GATA1/2等促进巨核细胞生成的基因的表达量逐渐降低；而促FOG1、EVI1等进巨核细胞向血小板分化的基因表达随着分化天数的增加逐渐升高；与血小板功能相关的CD62P基因的表达量逐渐接近人血小板样品中的表达量。（3）体外功能结果表明：免疫荧光染色表明巨核细胞和血小板表达CD62P，因此分化的血小板可能有体内凝集的功能；血小板被ADP激活后，与PAC1的结合比例可达到72%。（4）体内功能分析结果表明：使用环磷酰胺对小鼠造模后，小鼠体内的血小板比例明显降低，小鼠的体重降低，凝血时间延长；将分化的血小板和人血小板样品分别通过尾静脉注射到血小板减少模型小鼠体内，两组模型小鼠的凝血时间和止血时间均缩短，并且发现分化的血小板的止血和凝血能力接近于人血小板样品；检测发现小鼠体内，人源血小板与分化的血小板的比例随时间的变化而发生变化，在注射后的第4小时达到最高峰之后逐渐降低。结论：本研究将CD34阳性细胞分化为巨核细胞及血小板的方法优化为3个阶段，通过此方法，能够得到较高纯度的巨核细胞和血小板。证实了分化的巨核细胞具有产生血小板的能力，且分化的血小板是具有体内的止血和凝血能力的功能性血小板。

作者：

钟志勇

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关键词：

功能性血小板脐带血 CD34阳性细胞体外分化巨核细胞

授予学位：

硕士

学科专业：

生物学

导师：

段玉友

学位年度：

2021

学位授予单位：

华南理工大学

语种：

中文

中图分类号：