摘要
【目的】 1.评估高盐饮食对小鼠认知功能、肠道菌群组成、短链脂肪酸含量、血脑屏障功能、神经炎症和凋亡等的影响。 2.探索肠道菌群在高盐相关认知障碍中的作用。 3.探索短链脂肪酸、肠菌来源EVs在高盐相关认知障碍中的作用及机制。 【方法】 1.动物实验小鼠分组：第一部分实验，将C57小鼠分为高盐组（HS组）和对照组（CON组），分别给予含8%氯化钠的高盐饲料和含0.5%的普通饲料两组饲养8周；第二部分实验，通过抗生素干预肠道菌群，将C57小鼠分为CON组、HS组、ANTI（抗生素）组和ANTI+HS组，分别给予含0.5%的普通饲料、含8%氯化钠的高盐饲料、联合抗生素水、联合抗生素水+高盐饲料饲养8周；第三部分实验，对C57小鼠分为CON组、HS组、FMT（粪菌移植）组、GLPG组和SCFA+HS组，分别给予含0.5%的普通饲料、含8%氯化钠的高盐饲料、清除肠菌后移植高盐小鼠肠道菌群、短链脂肪酸受体FFAR2拮抗剂GLPG0974、含混合短链脂肪酸的饮用水+高盐饲料饲养8周。 2.对小鼠称重，24小时代谢实验评价评估小鼠进食、饮水等基本情况。Morris水迷宫/新物体识别评价小鼠空间学习和记忆能力。16SrRNA高通量测序技术分析小鼠肠道菌群组成。EvansBlue方法检测小鼠血脑屏障功能。气相色谱法/超高效液相色谱-串联质谱法测定粪便、血清中短链脂肪酸浓度。酶联免疫吸附法（ELISA）测定小鼠脑皮质IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎细胞因子的浓度。免疫荧光、Westernblot检测肠道及脑组织屏障功能相关蛋白claudin5、小胶质细胞标记蛋白iba1、凋亡相关蛋白caspase-3、cleavedcaspase-3、caspase-1的表达。Hoechst染色/TUNEL检检测脑组织细胞凋亡。 3.所有计量资料均表示为平均值±标准差。两组间差异性比较采用t检验，多组间差异性比较采用单因素方差分析或双因素方差分析，两两比较采用是LSD法，Plt;0.05认为具有统计学意义。统计软件使用SPSS22.0，作图软件使用GraphpadPrism8.0。 【结果】 1.与CON组相比，HS组小鼠饮水量、尿量、尿钠、钠摄入/排出量、总的钠潴留量显著增加（Plt;0.001）。Two-wayANOVA分析显示，HS组小鼠在水迷宫定向航行阶段第4、5天找到平台的时间即逃避潜伏期显著增加（Plt;0.05）；T-test分析显示，在空间探索阶段HS组小鼠原平台所在象限时间、路程、穿越平台次数均显著下降（Plt;0.05或Plt;0.01）。T-test分析显示，两组肠菌组成差异显著：HS组小鼠拟杆菌门和变形菌门的比例显著降低（Plt;0.05），而硬壁菌门的比例则显著增加（Plt;0.05）。Two-wayANOVA分析显示，HS组小鼠粪便短链脂肪酸下降，其中乙酸含量显著降低（Plt;0.001）。ELISA显示HS组小鼠脑皮质炎症因子表达水平显著升高（Plt;0.001）。T-test分析显示，HS组小鼠皮层与海马组织凋亡细胞占比均增加，其中皮层平均凋亡细胞率显著增加（Plt;0.05）。WB显示caspase-1、3和cleavedcaspase3表达水平显著增加（Plt;0.05）。HS组小鼠海马Iba1阳性细胞数及蛋白表达量显著增加（Plt;0.05）。T-test分析显示，HS组小鼠脑组织内EvansBlue含量显著升高（Plt;0.01），claudin5表达量显著减少（Plt;0.05）。 2.Two-wayANOVA分析显示从第5周开始ANTI+HS组小鼠比对照组小鼠体重显著减轻（Plt;0.001）；HS组和ANTI+HS组小鼠尿钠、钠摄入/排出量、总的钠潴留量显著增加（Plt;0.01）。Two-wayANOVA分析显示，HS组小鼠第4天逃避潜伏期显著增加（Plt;0.01）；ANTI+HS组小鼠比CON组逃避潜伏期增加增加。ANTI+HS组比CON组平均游泳速度/距离显著降低（Plt;0.05）；空间探索实验中，HS组和ANTI+HS组比CON组穿越平台次数显著降低（Plt;0.05）。ANTI组、ANTI+HS组小鼠拟杆菌门/硬壁菌门占比均显著下降，变形菌门/疣微菌属门占比显著升高（Plt;0.01）。Two-wayANOVA分析显示，ANTI组、ANTI+HS组粪便短链脂肪酸含量均下降，其中乙酸/丙酸含量显著降低（Plt;0.05）。单因素方差分析显示，HS组、ANTI+HS组小鼠脑皮质平均IL-1β水平显著升高（Plt;0.05）。ANTI+HS组小鼠脑皮质平均IL-6水平显著升高（Plt;0.05）。单因素方差分析显示，ANTI+HS组比HS组小鼠脑组织海马CA1区平均细胞凋亡比例显著增加（Plt;0.05）。双因素方差分析显示，HS组、ANTI+HS组小鼠脑皮层caspase-1的表达水平显著升高（Plt;0.05）。HS组、ANTI组、ANTI+HS组小鼠脑中EvansBlue含量均有所增加。单因素方差分析显示，HS组、ANTI组、ANTI+HS组小鼠海马组织claudin5蛋白表达水平均显著降低（Plt;0.001）。ANTI+HS组海马组织iba1表达水平比HS组显著降低（Plt;0.001）。 3.与CON组、HS组、FMT组相比，GLPG组、SCFA+HS组小鼠平均体重显著减轻（Plt;0.001）。单因素方差分析显示，GLPG组小鼠自发活动路程显著增加，HS组、FMT组小鼠探索新物体时间占比显著减少（Plt;0.05）。SCFA+HS组小鼠探索新物体时间高于HS组。CON组、HS组、FMT组、GLPG组、SCFA+HS组乳酸杆菌科（Lactobacillaceae）丰度差异显著（Plt;0.01），HS组、SCFA+HS组比CON组、GLPG组乳酸杆菌科显著降低（Plt;0.05）。TwowayANOVA分析显示，HS组血清乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、异己酸含量均降低，其中乙酸含量显著降低（Plt;0.01）。FMT组小鼠与CON组相比，血清中平均乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、异己酸含量降低。SCFA+HS组小鼠血清平均乙酸含量比HS组显著增加（Plt;0.05）。GLPG组小鼠血清中平均乙酸水平比其余四组均显著增加（Plt;0.001）。HS组小鼠粪便中平均乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、异己酸含量比CON组降低，平均乙酸含量显著降低（Plt;0.01）。GLPG组粪便中平均乙酸/丁酸含量显著降低（Plt;0.01）。SCFA+HS组小鼠粪便中平均乙酸含量比HS组显著升高（Plt;0.001）。FMT组小鼠平均丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、异己酸含量降低。单因素方差分析结果显示，FMT小鼠血清以及脑组织IL-1β、IL-6、TNF-α和血清LBP水平均升高，其中血清LBP水平显著升高（Plt;0.05）。SCFA+HS组小鼠血清以及脑组织IL-1β、IL-6、TNF-α和血清LBP水平比HS组均显著降低（Plt;0.05）。GLPG组小鼠血清LBP水平显著升高（Plt;0.05）。单因素方差分析显示，FMT组小鼠脑组织海马CA1区平均细胞凋亡比例显著增加（Plt;0.05）。单因素方差分析WB结果显示，FMT组小鼠脑组织cleavedcaspase-3、caspase-3和caspase-1的表达显著升高，SCFA+HS组小鼠脑组织cleavedcaspase-3、caspase-3表达水平比HS组降低，caspase-1的表达水平比CON小鼠显著升高（Plt;0.05）。FMT组小鼠脑内EvansBlue含量显著升高（Plt;0.05）。免疫荧光及WB显示，FMT、SCFA+HS组小鼠海马iba1表达显著升高（Plt;0.05）。免疫荧光染色及WB显示HS组、GLPG组、FMT组、SCFA+HS组小鼠结肠组织claudin5表达水平均显著降低。 4.HS肠菌来源的EVs可以经胃肠道进入脑组织中，并且与脑内小胶质细胞、神经元共定位。 【结论】 1.高盐引起认知障碍，伴随肠菌改变、SCFA减少、神经炎症、BBB通透性升高、脑内小胶质细胞活化、细胞凋亡增多。 2.抗生素使小鼠菌群组成显著改变，并减少短链脂肪酸水平。抗生素加高盐小鼠，出现空间学习记忆功能障碍、神经炎症、BBB通透性升高，并且小鼠体重减轻，死亡增加，粪便短链脂肪酸减少更多。 3.粪菌移植实验结果表明，高盐引起的肠菌改变可能是高盐引起认知障碍的原因。补充短链脂肪酸可以恢复高盐小鼠粪便、血清短链脂肪酸水平，部分恢复空间学习记忆功能障碍、神经炎症、凋亡，但存在屏障通透性升高，并且小鼠体重减轻。短链脂肪酸受体拮抗剂GLPG0974使粪便SCFA减少，但并不减少循环SCFA，小鼠出现焦虑、体重减轻。高盐肠菌来源的EVs可以经肠道进入脑组织，与神经元、小胶质细胞共定位。EVs可能是高盐引起认知障碍的途径。EVs对脑内细胞功能的影响需要进一步研究。
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