摘要
布鲁氏菌病（Brucellosis）是一种由布鲁氏菌（Brucella）感染引起的人兽共患病，详尽掌握其致病机制，是预防和治疗该病的前提所在。布鲁氏菌介导的细胞凋亡与其胞内存活紧密相关，由内质网应激引发的细胞凋亡途径近年来愈发走进学者们的视野。线粒体融合蛋白2(Mitofusin2，MFN2)位于线粒体外膜，在细胞凋亡以及内质网应激过程中扮演重要角色，还与病毒以及病原菌感染存在潜在联系，但在布鲁氏菌感染过程中，它发挥了什么样的作用还不得而知。 目的：（1）探究布鲁氏菌对内质网应激介导的巨噬细胞凋亡的影响；（2）建立MFN2基因干扰和过表达瞬时转染细胞模型；（3）探究布鲁氏菌感染过程中MFN2是否参与调控内质网应激介导的巨噬细胞凋亡。 方法：（1）本研究首先用布鲁氏菌A19体外感染小鼠RAW264.7细胞，通过qRT-PCR、Westernblot和流式细胞术检测内质网应激标志性分子（GRP78、CHOP）以及凋亡相关基因（BAX、BCL-2）的激活情况，检测MFN2的表达情况。（2）借助转染介质将干扰序列和重组质粒转染进RAW264.7细胞，qRT-PCR以及Westernblot共同检测它们对MFN2的干扰和过表达效率（3）在MFN2干扰/过表达状态下用布鲁氏菌侵染，通过qRT-PCR、Westernblot和流式细胞术检测内质网应激标志性分子及凋亡相关基因的表达情况，检测细胞凋亡率，通过菌落计数（CFU）评估布鲁氏菌的胞内存活变化。 结果：（1）布鲁氏菌能够引起GRP78、CHOP以及BAX表达水平升高，而BCL-2表达下降，细胞凋亡率升高；并可抑制MFN2的表达。（2）从预选的3条siRNA序列中筛选出siMFN2-1661为最佳干扰序列，效率为68%，鉴定出pCDNA3.1-EGFP-MFN2重组质粒对MFN2的过表达效率在8倍左右。（3）MFN2干扰后促进了布鲁氏菌引起的GRP78以及BAX表达水平升高，细胞凋亡率升高，而胞内活菌数降低；MFN2过表达后抑制了布鲁氏菌引起的GRP78以及BAX表达水平升高，细胞凋亡率降低，胞内活菌数升高。 结论：（1）本研究证实布鲁氏菌能够诱导内质网应激从而介导巨噬细胞凋亡；（2）利用RNA干扰和过表达技术成功的将MFN2基因进行了干扰和过表达；（3）发现MFN2的干扰能够促进布鲁氏菌诱导内质网应激及细胞凋亡的能力，且在一定程度上抑制布鲁氏菌的胞内存活；而MFN2的过表达则抑制布鲁氏菌诱导内质网应激及细胞凋亡的能力，并在一定程度上促进布鲁氏菌的胞内存活。
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