摘要
菜豆（PhaseolusvulgarisL.）是豆科菜豆属一年生草本植物，在世界范围内广泛种植，具有很高的食用价值。但纤维过高的菜豆会影响其食用口感，因此，培育低纤维高品质的菜豆品种对于农业的发展至关重要。为探究纤维素合酶CesA基因在不同纤维水平菜豆中的作用机制，通过基因组分析鉴定出15个PhvulCesA基因，并比较其在‘白珍珠’和‘玉冠’两个菜豆品种不同组织中的表达模式。分别构建CRISPR/Cas9载体遗传转化‘白珍珠’菜豆，成功获得菜豆抗性芽；构建过表达载体异源转化拟南芥，经潮霉素（Hygromycin，Hyg）筛选、PCR、RT-PCR和RT-qPCR等分子鉴定，成功获得阳性转基因拟南芥植株。为揭示PhvulCesA基因在菜豆中的作用机制，培育低纤维高品质的菜豆品种提供理论支撑。研究结果如下： 1．通过基因组分析共鉴定出15个PhvulCesA基因，分布在7条染色体上。基因长度在2655-3294bp，氨基酸数目为884-1097aa，分子量为100.65-123.78g/mol，等电点分布在5.89-8.18，外显子数量在10-14之间。系统进化树分析将CesA分为GroupA-GroupF6组，其中，GroupA、GroupB和GroupF内基因参与初生壁PCW的形成，GroupC、GroupD和GroupE内基因参与次生壁SCW的形成，同一组内的不同基因具有相同的motif。15个PhvulCESA中均具有cellulose-synt结构域，其中11个具有RING结构域，13个具有zf-UDP结构域，具有6个或8个跨膜结构域。 2．半定量RT-PCR和RT-qPCR分析结果表明，15个PhvulCesA基因在菜豆‘白珍珠’中的表达水平均高于‘玉冠’。Phvul002G240200、Phvul005G010400、Phvul007G190300和Phvul009G205200基因的表达在两个品种豆荚之间差异最大。 3．利用CRISPR/Cas9技术构建Phvul002G240200、Phvul005G010400和Phvul007G190300基因编辑载体，经PCR检测和测序验证鉴定正确后，转入农杆菌EHA105中，构建成功的农杆菌侵染‘白珍珠’菜豆愈伤组织，获得抗性芽。 4．同时构建Phvul007G190300基因过表达载体，经PCR检测和测序验证鉴定正确后，转入到农杆菌GV3101中，采用蘸花法侵染Col-0型拟南芥，经PCR、RT-PCR、RT-qPCR等分子检测显示，外源基因已成功导入拟南芥基因组DNA中，并在转录水平得到表达。过表达菜豆Phvul007G190300基因的拟南芥中，可观察到拟南芥根部明显变粗，根毛变多且根毛密度显著增加。对Phvul007G190300基因在转基因拟南芥豆荚中表达情况进行分析，结果表明，Phvul007G190300基因在3株Phvul007G190300-OE拟南芥的豆荚中均有所表达。对转基因拟南芥果荚中纤维素含量测定，结果显示，过表达菜豆Phvul007G190300基因拟南芥果荚中的纤维素含量高于野生型拟南芥，表明PhvulCesA基因在纤维发育过程中发挥着重要作用。 这些研究结果为进一步利用分子遗传学等手段改良菜豆品种奠定基础。
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