摘要
【背景】 马拉色菌属为脂质依赖性酵母，目前发现18个种，其中球形马拉色菌（Mg）、限制性马拉色菌和合轴马拉色菌是人类皮肤最常见分离菌种。马拉色菌既是人类和哺乳动物皮肤共生菌，又可引起头皮屑、脂溢性皮炎、花斑糠疹、马拉色菌性毛囊炎（MF）、脓毒血症，加重特应性皮炎、银屑病，可能还参与阿尔茨海默病、克罗恩病、胰腺导管腺癌发生。 模式识别受体（PRR）包括Toll样受体（TLR）、C型凝集素受体（CLR）、RIG-1样受体（RLR）、NOD样受体（NLR）、AIM2样受体（ALR），可识别入侵真菌表达的病原相关分子模式（PAMP）及组织损伤释放的损伤相关分子模式（DAMP）。炎症小体作为胞质内多聚体蛋白平台，在抗真菌感染中起关键作用。目前已知5种经典炎症小体，即NLRP1、NLRC4、NLRP3、AIM2、pyrin炎症小体，其中NLRP3炎症小体研究最多。白色念珠菌、烟曲霉、隐球菌、巴西副球孢子菌、马拉色菌、毛癣菌、犬小孢子菌等真菌可激活髓样细胞NLRP3炎症小体，但其对角质形成细胞（KC）NLRP3炎症小体激活的有关研究较少。真菌通过激活NLRP3炎症小体，活化半胱天冬酶（Casp）-1裂解IL-1β、IL-18及gasderminD（GSDMD），引起成熟IL-1β、IL-18释放，并可能导致焦亡。此外，真菌也可通过激活NLRP3炎症小体活化Casp-8。 Park等报道马拉色菌激活KC中NLRP3炎症小体。我们前期研究发现，MF皮损中NLRP3、Casp-1、IL-1β、TLR2、TLR4、Dectin-1、Dectin-2、NF-κB表达增加，马拉色菌上调HaCaT细胞NLRP3、Casp-1、IL-1β表达，提示马拉色菌感染可能激活KC中TLR2/4、Dectin-1/2、NLRP3炎症小体，但具体激活机制不明。 【目的】 1.明确Mg激活HaCaT细胞NLRP3炎症小体； 2.了解TLR2/4-MyD88-NF-κB、Dectin-1/2-Syk信号通路在Mg激活HaCaT细胞NLRP3炎症小体中作用； 3.探讨K+外流、Ca2+内流、细胞吞噬、溶酶体损伤、线粒体损伤、活性氧（ROS）在Mg激活HaCaT细胞NLRP3炎症小体中作用。 【方法】 1.Mg培养和热灭活Mg制备：将Mg标准株（CBS9597）接种在改良LNA液体培养基，PBS洗涤并调整菌液浓度至1×109个/ml。Mg孢子用95℃水浴灭活10min。 2.HaCaT细胞培养和Mg感染：HaCaT细胞于DMEM完全培养基37℃、5%CO2培养。Mg组、热灭活组分别加入30感染复数（MOI）Mg或热灭活Mg感染HaCaT细胞24h。 3.RNA干扰：HaCaT细胞中加入靶向人NLRP3、ASC、Casp-1、TLR2、TLR4、Dectin-1、Dectin-2siRNA和scramblesiRNA转染36h，换液后加入30MOIMg共培养24h。 4.蛋白印迹（WB）：按实验要求收集细胞，蛋白裂解后进行SDS-PAGE，转移到硝酸纤维素膜，并与相应一抗（抗人NLRP3、ASC、Casp-1、Cleaved-Casp-1、Casp-8、Cleaved-Casp-8、IL-1β、Cleaved-IL-1β、TLR2、TLR4、MyD88、Dectin-1、Dectin-2、p-Syk、Syk、p-NF-κB、NF-κB、组织蛋白酶B、GSDMD、N-GSDMD）孵育，再用过氧化物酶标记二抗孵育，最后通过强化学发光可视剂曝光。 5.免疫共沉淀（Co-IP）：30MOIMg感染HaCaT细胞24h，收集蛋白裂解液，将ASC抗体预孵育磁珠加入裂解液过夜，收集抗体/蛋白复合物进行SDS-PAGE，加入相应一抗（抗人NLRP3、ASC、Casp-1、Casp-8），WB验证细胞内ASC互作蛋白。 6.抑制剂预处理：HaCaT细胞分别加入不同浓度Casp-1抑制剂Z-YVAD-FMK（10μM、20μM）、Casp-8抑制剂Z-IETD-FMK（10μM、20μM）、TLR2抑制剂C29（25μM、50μM）、TLR4抑制剂Resatorvid（TAK-242，0.1μM、0.5μM）、Dectin-1抑制剂Laminaran（5μg/mL、10μg/mL）、K+离子抑制剂格列本脲（50μg/mL、100μg/mL）、Ca2+螯合剂BAPTA-AM（10μM、20μM）、吞噬抑制剂松胞菌素D（2μM、4μM）、组织蛋白酶B抑制剂CA-074-Me（50μM、100μM）、ROS抑制剂N-乙酰半胱氨酸（NAC，5mM、10mM）、Syk抑制剂Piceatannol（10μM、20μM）、NF-κB抑制剂BAY11-7082（0.1μM、0.5μM）、MyD88抑制剂ST-2825（5μM、10μM）处理1h，随后加入30MOIMg共培养24h。 7.细胞免疫荧光 7.1单色免疫荧光：收集细胞，4%多聚甲醛溶液固定，加入一抗（TLR2、TLR4、Dectin-1或Dectin-2）4℃孵育过夜，FITC标记IgG二抗孵育后DAPI复染胞核，激光共聚焦显微镜观察HaCaT细胞TLR2/4、Dectin-1/2表达。 7.2双色免疫荧光：处理后细胞加入MitoTrackerRedCMXRos荧光探针孵育30min，4%多聚甲醛溶液固定，加入羊NLRP3单抗或兔ASC单抗4℃孵育过夜，加入Dylight594/488标记IgG二抗，DAPI复染胞核，激光共聚焦显微镜观察HaCaT细胞NLRP3、ASC向线粒体转位。 7.3三色免疫荧光：收集细胞，4%多聚甲醛溶液固定，加入一抗混合物（羊NLRP3单抗+兔ASC单抗+鼠Casp-1单抗）4℃孵育过夜，加入Dylight594/488/654标记驴抗山羊/兔/鼠IgG二抗，激光共聚焦显微镜观察NLRP3、ASC、Casp-1在HaCaT细胞内共定位情况。 8.荧光探针染色：Mg感染HaCaT细胞分别加入1μMPBFI-AM、5μMFluo-4AM、5μMDCFH-DA、200nMMito-TrackerRedCMXRos或75nMLyso-TrackerRedDND-99荧光探针处理0.5-1h，荧光显微镜观察细胞内K+、Ca2+、ROS、溶酶体和线粒体膜电位荧光强度。 9.透射电子显微镜观察：收集细胞，常规固定、脱水、渗透、包埋，超薄切片，JEM-1400透射电子显微镜观察Mg感染HaCaT细胞孢子吞噬及超微结构变化。 10.统计学分析：使用SPSS23.0软件进行数据分析，采用单因素方差分析及LSD检验。 【结果】 1.Mg激活HaCaT细胞NLRP3炎症小体 30MOIMg或热灭活Mg感染HaCaT细胞24h，以脂多糖+ATP作为阳性对照，WB显示活或热灭活Mg显著增加NLRP3、Casp-1、Cleaved-Casp-1、GSDMD表达（Plt;0.001-0.05），其中活Mg更明显。HaCaT细胞NLRP3、ASC、Casp-1基因沉默后，WB显示NLRP3、ASC基因沉默后明显抑制Cleaved-IL-1β表达（Plt;0.001），但Casp-1基因沉默后Cleaved-IL-1β无明显改变（Pgt;0.05）。N-GSDMD表达仅在NLRP3沉默后减少（Plt;0.05）。进一步使用Casp-1抑制剂Z-YVAD-FMK可降低Cleaved-Casp-1、Cleaved-Casp-8、Cleaved-IL-1β表达（Plt;0.001-0.05）。Mg感染HaCaT细胞可引起Casp-8时间依赖性增多，Casp-8抑制剂Z-IETD-FMK可抑制Cleaved-Casp-1、Cleaved-Casp-8、Cleaved-IL-1β表达（Plt;0.001-0.05）。Co-IP蛋白质印迹显示NLRP3、Casp-1、Casp-8分别与ASC结合。激光共聚焦观察NLRP3、ASC、Casp-1免疫荧光共定位显示，Mg感染HaCaT细胞后，ASC作为分子平台连接NLRP3与Casp-1。使用MitoTrackerRed荧光探针标记线粒体，激光共焦显微镜发现NLRP3或ASC向线粒体转位。 2.Mg通过TLR2/4、Dectin-1/2激活NLRP3炎症小体 激光共焦显微镜观察显示Mg感染后TLR2/4、Dectin-1/2在细胞膜和胞质中呈颗粒聚集。WB显示：50μMTLR2抑制剂C29和TLR2siRNA明显抑制ASC、Casp-1、IL-1β、Cleaved-IL-1β表达（Plt;0.001-0.01），但不影响NLRP3、N-GSDMD表达（Pgt;0.05）；0.5μMTLR4抑制剂Resatorvid和TLR4siRNA明显抑制NLRP3、IL-1β、Cleaved-IL-1β、GSDMD表达（Plt;0.001-0.05）；10μg/mLDectin-1抑制剂Laminaran和Dectin-1siRNA减少NLRP3、Casp-1、IL-1β、Cleaved-IL-1β、GSDMD表达（Plt;0.001-0.01）；Dectin-2siRNA抑制NLRP3、ASC、Casp-1、Cleaved-Casp-1、IL-1β、Cleaved-IL-1β、GSDMD、N-GSDMD表达（Plt;0.001-0.01）。 3.第二信号在Mg诱导HaCaT细胞NLRP3炎症小体激活中作用 透射电镜观察：HaCaT细胞吞噬Mg，引起自噬溶酶体增多及线粒体损伤。免疫荧光显示：Mg感染HaCaT细胞24h后，细胞内K+减少、Ca2+增多；Mg感染减弱HaCaT细胞Lyso-TrackerRed荧光强度（Plt;0.05）；Mg感染降低HaCaT细胞线粒体膜电位，增加ROS在细胞内蓄积（Plt;0.001）。 WB结果显示：4μM吞噬抑制剂松胞菌素D明显抑制Syk、NF-κB、NLRP3、ASC、Casp-1、Cleaved-Casp-1、Cleaved-IL-1β、N-GSDMD表达（Plt;0.001-0.05），但不影响IL-1β表达（Pgt;0.05）。Mg感染以时间和剂量依赖方式刺激组织蛋白酶B释放，其中30MOIMg感染24h后组织蛋白酶B表达最明显；100μM组织蛋白酶B抑制剂CA-074-Me明显抑制Syk、NF-κB、NLRP3、ASC、Casp-1、Cleaved-Casp-1、IL-1β、Cleaved-IL-1β、N-GSDMD（Plt;0.001-0.05）；10mMNAC抑制NF-κB、NLRP3、ASC、Casp-1、IL-1β、Cleaved-IL-1β、N-GSDMD、组织蛋白酶B（Plt;0.001），而Syk、Cleaved-Casp-1、GSDMD无明显改变（Pgt;0.05）。 4.Syk、NF-κB、MyD88信号通路在Mg诱导HaCaT细胞NLRP3炎症小体激活中作用 Syk抑制剂Piceatannol（10μM、20μM），NF-κB抑制剂BAY11-7082（0.1μM、0.5μM）、MyD88抑制剂ST-2825（5μM、10μM）预处理HaCaT细胞1h，再用30MOIMg刺激24h，WB结果显示：20μMSyk抑制剂Piceatannol可抑制NLRP3、ASC、Casp-1、IL-1β、Cleaved-IL-1β表达（Plt;0.05），对Cleaved-Casp-1无影响（Pgt;0.05）。0.5μMNF-κB抑制剂BAY11-7082明显抑制NLRP3、ASC、Cleaved-Casp-1、Cleaved-IL-1β表达（Plt;0.01），而Casp-1、IL-1β表达影响较小（Plt;0.05）；10μMMyD88抑制剂ST-2825明显抑制NLRP3、ASC、Casp-1、IL-1β表达（Plt;0.001），但对Cleaved-Casp-1、Cleaved-IL-1β表达影响较小（Pgt;0.05）。 30MOI球形马拉色菌分别感染HaCaT细胞0、15、30、45、60、120min，检测信号通路Syk、NF-κB、MyD88中关键信号分子及其磷酸化蛋白表达，筛选最佳的观察时间点为30min。Syk抑制剂Piceatannol（10μM、20μM），NF-κB抑制剂BAY11-7082（0.1μM、0.5μM）、MyD88抑制剂ST-2825（5μM、10μM）预处理HaCaT细胞1h，再用30MOIMg刺激30min，WB结果显示：20μMSyk抑制剂Piceatannol可明显抑制p-Syk、p-NF-κB、MyD88表达（Plt;0.01），但对CARD9无明显影响（Pgt;0.05）；0.5μMNF-κB抑制剂BAY11-7082明显抑制p-NF-κB、MyD88表达（Plt;0.01），轻度抑制p-Syk、CARD9表达（Plt;0.05），但对Syk无抑制作用（Pgt;0.05）；10μMMyD88抑制剂ST-2825明显抑制MyD88、CARD9表达（Plt;0.001），但对p-NF-κB、p-Syk无明显影响（Pgt;0.05）。 1.Mg感染HaCaT细胞不仅激活经典NLRP3炎症小体，还激活了非经典Casp-8炎症小体。 2.Mg感染可激活HaCaT细胞TLR2/4-MyD88-NF-κB、Dectin-1/2-Syk通路，参与NLRP3炎症小体激活；Dectin-1/Syk通路可能在非经典Casp-8炎症小体激活中起重要作用。 3.Mg激活HaCaT细胞NLRP3炎症小体涉及K+外流、Ca2+内流、孢子吞噬、溶酶体损伤、线粒体损伤、ROS增加。
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