摘要
目的：雷公藤是一种传统中草药，作为药效显著的免疫抑制剂在临床已使用多年。雷公藤甲素(triptolide,TP)是从雷公藤中分离得到的一种环氧二萜内酯化合物，为雷公藤的主要活性及毒性成分。近几年有学者发现TP可以通过引起HIV编码蛋白（Tat）降解继而抑制HIV转录，从而增加CD4+细胞，减弱HIV感染者的病毒载量，关于雷公藤甲素抗艾滋病的研究在美国已进入Ⅲ期临床试验。此外，雷公藤甲素的水溶性产物Minnelide在各种临床前癌症（如急性髓样白血病、胰腺癌和肝癌等）模型中均显示出强效的抗肿瘤活性,目前正处于治疗晚期胰腺癌的II期临床试验中。雷公藤药效显著但是其毒副作用不容忽视，尤以肝脏、肾脏及生殖毒性为主。其中，肝脏作为人体最重要的代谢器官损伤最为严重，并且TP的肝脏毒性呈现剂量依赖性。如何在保证药效的同时减轻其肝毒性已成为目前的研究热点。关于TP肝损伤的机制假说目前多为氧化应激、凋亡、炎症等，铁死亡是一种由抗癌药物中提取出来的小分子RAS和Erastin诱导的可调控的细胞死亡方式。我们的研究目的是探讨雷公藤甲素所致的肝脏毒性是否同铁死亡相关，旨在合理利用“铁死亡”这一双刃剑，通过调控铁死亡相关因子平衡以维持机体的稳态环境，从而为临床减轻TP的肝毒性提供新的治疗靶点。 方法： 1.体内实验：雄性SD大鼠，220g~240g，待动物适应性喂养7天后，随机分为两组：对照组（Con）和雷公藤甲素组（TP2.4mg/kg）。各组均灌胃给药，TP组给予2.4mg/kg雷公藤甲素混悬液，Con组给予等容积0.5%羧甲基纤维素钠（CMC）。给药后72h，将动物称重、麻醉，眼内眦取血并分离血清，测定血清中各种生化指标ALT、AST、ALP、T-CHO和TG。之后，剖开腹腔，剪取肝脏并称重，计算肝脏系数。取肝中叶进行多聚甲醛固定，用于组织病理学检查，余下部分迅速冻于-80℃。采用试剂盒测定肝组织中抗氧化物酶及组织铁的含量。采用RT-PCR技术检测HMGB1、SLC39A14、Hepcidin、ACSL4、FPN1、p53、GSH、GPX4和Nrf2等mRNA的表达。采用WesternBlot技术测定MnSOD、NF-κB、GPX4、Bax和Bcl-2等蛋白含量。 2.体外实验： 选用人源L02肝细胞系，常规培养，采用CCK8检测TP对L02细胞生存率的影响，计算其IC50，采用略低于IC50的TP浓度用于后续实验。分别在Ferrostatin-1(Fer-1)、Emricasan(EMC)存在与否的情况下，观察TP对L02细胞存活率的影响。在Fer-1存在与否的情况下，采用C11-BODIPY探针观察TP对脂质过氧化的影响，运用ROS探针观察TP对活性氧的影响，用AnnexinV-FITC-PI探针观察TP对细胞凋亡的影响，用WesternBlot技术检测TP对GPX4蛋白表达的影响。 结果： 1.动物的一般情况 TP2.4mg/kg灌胃给药24、48和72h后，和Con组相比，TP组动物摄食量下降，体重明显降低（Plt;0.05或0.01）。 2.血清生化结果 与Con组相比，TP组给药72h时，大鼠血清中ALT、AST、ALP、T-CHO及TG水平均明显升高（Plt;0.05或0.01）。 3.肝脏组织病理学检查 Con组和TP组肝脏外观并无明显差异。肝组织经H-E染色后发现，Con组肝组织肝索呈放射状排列，肝细胞核位置整齐均一，肝窦中无明显充血；TP组肝脏中存在静脉充血以及肝索排列紊乱的现象，肝细胞中可见明显的核碎裂以及核溶解现象，伴有细胞坏死及嗜酸性细胞-凋亡小体的存在。 肝组织切片经普鲁士蓝染色发现，同Con组相比，TP组肝细胞胞浆蓝染明显（含铁血黄素沉积）。 4.肝组织抗氧化物酶及组织铁的含量测定 和Con组相比，TP组肝组织中GSH-Px酶活力水平降低（Plt;0.01），MnSOD的蛋白表达减少(Plt;0.05），而对总铁含量影响不大。 5.肝脏组织中铁死亡及凋亡相关蛋白的表达检测 WesternBlot结果显示，和Con组相比，TP组GPX4及NF-κB的表达降低（Plt;0.01），Bax/Bcl-2比值增加（Plt;0.05）。 6.肝脏组织中铁死亡相关基因的检测 同Con组相比，TP组肝组织中HMGB1、FPN1、p53、ACSL4等基因有不同程度的上调，其中HMGB1、FPN1和ACSL4有统计学差异（Plt;0.05或0.01）。而Hepcidin、SLC39A14、GSH、GPX4和Nrf2有不同程度的下调，除Nrf2外均有统计学差异（Plt;0.05或0.01）。 7.L02细胞生存率的检测 TP和L02细胞作用24h的IC50为80nM,我们采用20nM用于后续的实验。TP与Fer-1或EMC分别和L02细胞作用24h后，和单独应用TP组相比，均能使下降的细胞存活率不同程度的恢复。 8.Fer-1对TP所致脂质过氧化的影响 经共聚焦显微镜观察，用C11-BODIPY处理L02细胞后，TP组细胞绿色荧光较对照组和Fer-1组增强，红色荧光减弱，而TP+Fer-1组显示绿色荧光较TP组减弱，红色荧光增强。 经流式细胞仪检测，用C11-BODIPY处理L02细胞后，TP组FITC荧光强度高于对照组及Fer-1组，而TP+Fer-1组FITC荧光强度有所减弱。 经流式细胞仪检测，用ROS探针处理L02细胞，TP组FITC荧光强度高于对照组及Fer-1组，而TP+Fer-1组荧光强度有所减弱。 9.Fer-1对TP所致L02细胞凋亡的影响 用AnnexinV-FITC-PI探针孵育L02细胞后，经流式细胞仪观察，TP组凋亡细胞增多，而Fer-1对TP所导致的L02细胞凋亡情况未见明显的逆转作用。 10.Fer-1和TP对L02细胞GPX4蛋白表达的影响 同对照组相比，Fer-1组GPX4同对照组相比表达未见明显差异，TP组GPX4表达明显降低（Plt;0.01），TP+Fer-1共处理组GPX4蛋白表达升高（Plt;0.05）。 结论： 1.整体实验提示，TP对SD大鼠的急性肝损伤作用与其可致肝组织发生铁死亡及凋亡有关。 2.细胞实验显示，铁死亡抑制剂对TP所致的L02肝细胞损伤有明显的抑制作用，这一作用和促进GPX4的蛋白表达有关。
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