摘要
研究背景： 随着生活水平的提高，以非酒精性脂肪肝（Non-alcoholicfattyliverdisease,NAFLD）为代表的糖脂代谢病患者越来越多，糖脂代谢病在全球范围内威胁人类的健康，是公认的世界卫生难题之一。目前对于糖脂代谢病的研究主要聚焦于肝，中医认为“肝”在机体生命活动中主要起“枢纽”平衡作用，协调其他脏腑功能顺利进行。西医认为肝脏是机体内以代谢为主的重要器官，是大部分生化反应的场所，能够维持机体稳态。近年来，各类肝脏疾病如病毒性肝炎、肝纤维化、药物性肝损伤等发病率升高，而肝损伤又是各类肝脏疾病发生发展的病理生理基础，所以肝损伤逐渐受到了人们的重视。内质网应激(Endoplasmicreticulumstress,ERS)是包括糖尿病、肥胖和血脂异常等多种疾病的关键致病因素，由于持续的ERS会导致肝损伤及肝代谢异常，引起肝硬化、肝癌甚至死亡。所以，寻找针对ERS型肝损伤疗效好的药物是十分有必要的。 橙皮苷是我国传统中药佛手的主要组分，具有抗炎、抗病毒、抗感染、抗肿瘤、清除自由基和抗氧化等药理活性，并且能够降胆固醇、降血糖、降血脂，但是其具体的分子机制并不完全清楚。因此，本文构建了ERS型小鼠肝损伤模型，探讨橙皮苷对ERS所致实验小鼠肝损伤的保护作用及其作用机制。 研究目的： 观察橙皮苷对ERS所致的肝损伤小鼠模型的影响，从氧化应激、自噬、脂质代谢、UPR信号通路、肠道菌群等角度探讨橙皮苷对肝脏的保护作用及其作用机制。 研究方法： C57BL／6J品系雄性小鼠随机分为5组，分别为对照组（Control）、模型组（Model）、低剂量橙皮苷组（LDN）、中剂量橙皮苷组（MDN）和高剂量橙皮苷组（HDN）。以50mg/kg/d为低剂量，100mg/kg/d为中剂量，200mg/kg/d为高剂量每天定时灌胃。连续灌胃给药10d后，除Control组（腹腔注射150mM葡萄糖溶液）外，其余四组腹腔注射0.1μg/μl的衣霉素（Tunicamycin，TM），给药24h后，进行取材。血液及部分肝脏组织使用生化试剂盒检测。运用苏木精-伊红染色技术（Hamp;E）对肝脏进行病理分析，同时利用实时荧光定量PCR以及蛋白免疫印迹Western-blot等技术手段对ERS和脂质代谢相关基因的mRNA和蛋白水平、自噬相关基因的mRNA水平进行检测分析，采用16SrDNA测序对盲肠内容物进行分析。 研究结果： 1、成功构建ERS所致实验小鼠肝损伤的模型 与Control组小鼠相比，Model组小鼠出现明显病变，肝脏变白，肝实质颗粒轻微增粗，体积较大且质地较软，肝脏指数显著升高，Hamp;E结果显示Model组小鼠肝小叶界限模糊，肝细胞肿胀，肝索结构紊乱，胞质稀疏，部分位置细胞核溶解、坏死，ERS标志性基因CHOP、GRP78的mRNA含量显著升高，小鼠血浆生化指标谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）含量显著升高，甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）含量均显著降低，肝脏TG、TC含量显著升高，血清成纤维细胞生长因子21（FGF21）含量急剧升高，FGF21等mRNA含量显著增加。 2、橙皮苷对ERS所致实验小鼠肝损伤具有保护作用 与Model组相比，橙皮苷提前给药组肝脏指数、ALT、AST均呈下降趋势，尤其是高剂量组显著降低，通过Hamp;E染色观察到尤其是高剂量组肝脏呈红色，体积变小，肝细胞条索排列较为整齐，未见坏死。小鼠血浆生化指标ALT和AST下降趋势明显，TG、TC、HDL-C、LDL-C含量均呈上升趋势，肝脏TG、TC含量显著降低，血清FGF21含量下降，FGF21等mRNA含量也显著降低。 3、橙皮苷对ERS所致实验小鼠肝损伤保护作用的机制 与Model组相比，橙皮苷提前给药组谷胱甘肽（GSH）含量显著增加，丙二醛（MDA）含量显著降低，自噬相关基因的mRNA含量呈上升趋势。ERS标志性基因CHOP、GRP78的mRNA和蛋白含量尤其是高剂量组显著降低，脂质代谢相关基因的mRNA及蛋白含量呈上升趋势，未折叠蛋白反应（UnfoldedProteinResponse，UPR）信号通路的mRNA及蛋白含量尤其是高剂量组下降明显。肠道益生菌显著增加。 研究结论： 本文构建了衣霉素诱导小鼠ERS所致的肝损伤小鼠模型，造模条件为腹腔注射0.1μg/μl衣霉素24h，橙皮苷对该模型小鼠肝损伤具有保护作用，其作用机制可能与减轻氧化应激损伤、调节肝脏自噬、改善肝脏代谢紊乱、调节UPR从而缓解ERS、调节肠道菌群有关。
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