黄鳍金枪鱼(Thunnusalbacares)，俗称黄鳍鲔，属于金枪鱼属，主要分布于印度洋、太平洋、大西洋热带、亚热带水域，在中国主要分布在南海和东海，是捕捞量最多的金枪鱼种类。黄鳍金枪鱼营养丰富，作为金枪鱼属中的一大经济鱼种，因加工产业量大，常产生大量废弃副产物，包括鱼头、鱼皮、肉糜、鱼内脏等，这些副产物同金枪鱼肉一样富含优质的蛋白质和小分子活性肽，已报道的金枪鱼活性多肽具有血管紧张素转化酶抑制活性、抗氧化活性和抗菌特性等，但其鱼糜作为蛋白来源用于提取制备免疫活性肽的研究鲜有报道。本文以黄鳍金枪鱼鱼糜为原料，用四种蛋白酶酶解工艺制备黄鳍金枪鱼多肽，体外RAW264.7细胞实验评价四种酶解物的免疫活性，获得免疫活性较高的胰蛋白酶酶解物TPT。TPT经SephadexG-15凝胶柱进一步分离纯化后获得免疫活性较高组分F1，并对其进行结构鉴定；采用Westernblot和受体抑制剂干预方法对F1的免疫调节作用机制进行了初步探究，最后采用分子对接技术筛选获得免疫活性肽，为黄鳍金枪鱼开发免疫调节食品或保健产品提供理论依据。主要研究结果如下： （1）与胃蛋白酶、碱性蛋白酶和复合蛋白酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶）酶解液相比，胰蛋白酶酶解液TPT在25-400μg/mL范围内能显著促进RAW264.7细胞增殖，当浓度为200μg/mL时细胞增殖率为113.76±1.29%(p＜0.001)，对细胞的吞噬指数最高，为185.11±5.96%(p＜0.001)；且仅有TPT能显著促进RAW264.7细胞释放NO(15.91±0.59μM,p＜0.001)。TPT富含组氨酸(11.59%)，赖氨酸(11.00%)和精氨酸(6.90%)，含量都高于其他蛋白酶酶解物，必需氨基酸(EAA)在四种酶解液中含量也最高，为51.09%，且分子量小于1000Da的占97.48%。TPT高免疫活性可能与其氨基酸组成和分子量分布有关。 （2）采用SephadexG-15凝胶层析对TPT中的免疫活性肽进一步分离纯化。通过体外免疫活性追踪，结果发现TPT九个凝胶组分中（F1-F9），F1对RAW264.7细胞的增殖率和吞噬指数最高，而且只有F1能显著促进NO的释放。另外，F1在200μg/mL浓度下能够显著刺激RAW264.7细胞分泌IL-1β、IL-6以及TNF-α，释放量分别为47.42±1.01(p＜0.01)、90.72±4.55(p＜0.01)和561.81±4.02(p＜0.001)pg/mL，并且呈现出剂量效应关系。经LC-ESI-MS/MS鉴定得到F1中含255个肽段，分子量分布在500-2500Da之间，富含Gln、Leu、Lys和Ile，超过40%肽序列的N端或C端存在Arg、Trp和Gln，且超过95%的肽序列等电点小于7。综合理论及数据分析，初步筛选出25条免疫活性可能较高的肽段，分别为AITDAAMMAEEL、ALSEELDLALNDMTTL、DIDDIELTLAK、DIDDLEITLAK、DIDDLELTLA、DQEGQDVLLFIDNIF、EQYEEEQEAK、GADPEDVILAAFK、IQLVEEELDR、ISFPVILIDEVLK、ISFPVLLLDEVLK、IVGDKDYSVTANSR、KVKHELEEAQER、KVQHELEEAQER、LSFPVILIDEVLK、LVILEGEVER、MEIQEIQLK、MEIQELQLK、MELQEIQLK、TIDDLEDELYAQK、TVLIMELINNVAK、VAAAAAA、VDDGEYDDVLAE、VIISAPSADAPMFV、VPVVNVSVVDLTVR，具体的免疫调节活性将通过进一步的分子对接和合成验证来确定。 （3）F1中的活性肽能作用于RAW264.7细胞膜上的TLR4和TLR2，使细胞内IKK磷酸化，激活IκB激酶，并促使P-NF-κBp65表达上调，进一步激活NF-κB信号通路，提高NO、IL-1β、IL-6和TNF-α等细胞因子的分泌来发挥免疫调节作用。另外F1与TLR4抑制剂(TAK-242)同时作用于RAW264.7细胞，可以显著抑制细胞释放NO、IL-1β、IL-6和TNF-α，F1与TLR2抑制剂作用能显著抑制细胞IL-6和TNF-α的分泌水平，表明F1刺激RAW264.7细胞分泌NO、IL-1β、IL-6和TNF-α更主要依赖于TLR4。分子对接结合得分结果显示活性肽与TLR4的结合更强于TLR2，其中，DQEGQDVLLFIDNIF与TLR4结合能与阳性对照TQIDKVVHFDKLPGFG相当，结合分数分别为-16.17和-16.14，DQEGQDVLLFIDNIF与TLR4结合囊中的结合位点形成氢键作用、电荷相互作用和疏水作用；TVLIMELINNVAK与TLR2的结合能力优于阳性对照WTSSTMMEER，结合分数分别为-10.03和-9.53，与TLR2结合囊中的结合位点形成氢键和疏水作用，从而激活信号转导通路，刺激介导巨噬细胞活化，发挥免疫调节活性。
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