摘要
背景： 肝郁脾虚证是临床常见证候，是以情志变化为基础的中医证型。肝郁脾虚证与糖脂代谢疾病关系密切，临床上肝郁脾虚证是糖脂代谢病早期的主要证候之一。复方贞术调脂方(FTZ)是团队带头人郭姣教授基于调肝启枢化浊法自主创制的方药，目前已作为院内制剂广泛使用，前期研究表明具有明显调脂降糖的功效。临床诊疗中发现肝郁脾虚证常与糖脂代谢紊乱并见，但无法明确其发病先后及致病关系。对于压力焦虑等因素致肝郁脾虚证成模时，机体是否会出现糖脂代谢紊乱，紊乱的具体表现是什么尚不清楚。FTZ是否可以通过对肝郁脾虚证的干预作用纠正糖脂代谢紊乱，恢复糖脂代谢的稳态，进而病证结合，达到早防早治糖脂代谢性疾病也不明确。基于此，本项目通过肝郁脾虚证动物模型研究，观察肝郁脾虚模型成立时，机体糖脂代谢情况，明确其是否存在糖脂代谢紊乱及FTZ的作用及其机制。为FTZ病证结合早期防治糖脂代谢紊乱提供新的思路与方法，为糖脂代谢病病证结合防治提供科学依据。 目的： 1.通过建立和评价肝郁脾虚证大鼠模型，研究FTZ对肝郁脾虚证大鼠模型的干预作用。 2.通过研究肝郁脾虚证大鼠糖脂代谢特征，确定肝虚脾虚证大鼠是否存在糖脂代谢紊乱，并探索FTZ对肝郁脾虚证大鼠糖脂代谢指标的干预作用。 3.从脑肠肽激素水平、肠道炎症和肠道微生态角度探讨FTZ改善肝郁脾虚大鼠糖脂代谢紊乱的机制。 方法： 1.采用慢性束缚应激方法建立肝郁脾虚证大鼠模型，FTZ作为干预药物。基于此分组如下：空白对照组（N）、肝郁脾虚证组（M）、FTZ给药组（FTZ），造模35天。综合采用多指标评价肝郁脾虚模型：包括动物宏观表征、进食量、体重、旷场实验、拉尾排便实验、血清D-木糖含量、皮质醇含量，并以此评价FTZ对肝郁脾虚证的干预作用。 2.综合采用多指标评价糖脂代谢紊乱：包括空腹血糖、OGTT实验、体脂含量、血清甘油三酯、胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、游离脂肪酸和肝脏甘油三酯。 3.从脑肠肽激素水平、肠道炎症和肠道微生态角度探讨FTZ的作用机制：ELISA测定血清白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、脂多糖（LPS）含量、肠组织胰高血糖素样肽1（GLP-1）、胆囊收缩素（CCK）、5羟色胺（5-HT）含量及下丘脑5-HT含量，观察肝脏组织、小肠组织病理切片，收集粪便进行肠道菌群16SrRNA测序，并用利用WesternBlot技术检测大鼠肝脏NF-KB、TLR4和肠Occludin蛋白的表达。 结果： 1.造模21天时，模型组大鼠出现大便稀溏、扎堆少动、毛发晦暗、不泽、不欲饮食和消瘦等表征，且此状态可持续至造模35天，未出现明显适应性改变，肝郁脾虚证大鼠进食量较对照组显著减少，体重显著降低，拉尾排便实验达100%，旷场实验移动格子数、直立次数和中央停留时间较对照组均显著减少，D-木糖显著降低，血清CORT含量显著升高，表明肝郁脾虚证动物模型造模成功。FTZ组绝望状态较模型组减少，稀便率减少，进食量虽无差异，但自第四周起，FTZ组较模型组组体重出现持续增长趋势。拉尾排便阳性率降低，达62.5%，旷场实验移动格子数、直立次数较模型组均增加，血清D-木糖显著升高，CORT含量降低。 2.肝郁脾虚证组体内脂肪含量明显降低，肝脏甘油三酯明显降低，但血清甘油三酯较对照组升高，游离脂肪酸明显升高，低密度胆固醇出现升高趋势，但空腹血糖未见明显异常。FTZ组体脂肪含量增加，肝脏甘油三酯升高，血清甘油三酯、低密度脂蛋白、游离脂肪酸均降低。 3.肝郁脾虚证大鼠炎性介质LPS、炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6显著升高，FTZ组LPS、TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显降低；肝郁脾虚证肠激素GLP-1、CCK、5-HT及脑神经递质5-HT升高，FTZ组肠激素GLP-1、CCK、5-HT及脑神经递质5-HT降低。肝脏病理切片显示有明显炎症，FTZ组肝脏组织病理炎症明显减轻；小肠病理切片显示模型组粘膜组织绒毛粘连融合，黏膜上皮层大量炎症细胞的浸润，绒毛结构不完整，且肠屏障紧密连接蛋白Occludin表达显著降低，FTZ组改善肠黏膜上皮损伤，增加Occludin蛋白表达；模型组出现以ε-变形杆菌增多为主的肠道菌群紊乱，FTZ组ε-变形细菌显著降低、乳杆菌显著升高；模型组NF-KB、TLR4蛋白表达升高；FTZ组NF-KB、TLR4蛋白表达降低。 结论： 1.结合大鼠宏观表征观察、行为学实验结果、拉尾排便实验、血清D-木糖、CORT含量，证实慢性束缚应激方法成功复制肝郁脾虚证大鼠模型。此外，FTZ能显著改善肝郁脾虚模型各项指标。 2.肝郁脾虚证大鼠出现明显脂质代谢异常，FTZ可明显改善脂质代谢异常。 3.长期慢性束缚应激可能通过脑肠肽激素失调，肠道菌群紊乱、肠道屏障破坏，内毒素释放进入血液循环，激活体内炎症免疫效应，导致脂质代谢异常。FTZ通过调节脑肠肽相关激素、改善肠道菌群结构、修复肠道屏障、降低LPS水平、抑制TLR4-NF-KB通路，改善体内炎症从而改善脂质代谢。
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