摘要
花鲈（Lateolabraxmaculatus）是我国重要的水产养殖鱼种，2018年产量超过16万吨。但在花鲈苗种培育过程中，由于缺乏科学合理的饲料投喂策略，严重影响早期成活率的提高。为了进一步了解鱼类食物摄入和能量代谢的内分泌调节机制，我们以花鲈为实验对象来开展相关研究。结果如下： 1.花鲈npff及其受体的鉴定、表达和NPFF肽对摄食的影响 神经肽FF（NPFF）是RF-酰胺肽的家族成员之一，参与控制脊椎动物的摄食行为。但是，关于NPFF肽对低等脊椎动物摄食相关过程的影响知之甚少。我们从花鲈中克隆并鉴定了四个全长cDNA，即npff，npffr1，npffr2-1和npffr2-2，合成了花鲈NPFF肽，使用双荧光报告基因实验来检测花鲈NPFF肽是否能与其三个受体结合。结果显示，NPFF肽能分别与其三个受体发生功能性相互作用以增强CRE启动子活性，表明合成的NPFF肽具有生物学活性。定量结果表明，npffmRNA在端脑、下丘脑、延髓、性腺和肌肉中表达量最高，但npffrsmRNA主要分布在中枢神经系统（CNS）中。对花鲈npff基因在大脑中的定位进行了研究，结果表明：在花鲈端脑、中脑和下丘脑的一些特定区域中检测到了表达npff基因的细胞，其中包括下丘脑中参与摄食调控的关键区域，暗示其可能参与花鲈的摄食调控过程。静态孵育实验结果表明花鲈NPFF肽可显着促进原代脑细胞中orexin（orx）和neuropeptideY（npy）mRNA的表达，并降低leptin（lep），somatostatin（ss）和cholecystokinin（cck）mRNA的表达。同样，NPFF肽也提高了肠和胃中gastrin（gas），ghrelin（ghrl）和motilin（mtl）mRNA的表达，并显着降低了cckmRNA的表达。这些数据表明，NPFF肽可能在调节花鲈摄食相关的过程中发挥促进作用。 2.花鲈foxo基因家族分析及其应对短期饥饿的表达变化 Foxo基因家族成员在哺乳动物的细胞分化、肿瘤抑制、新陈代谢、细胞周期停滞和细胞死亡中发挥重要作用，但在鱼类中并未对foxo基因家族进行系统研究。我们鉴定了花鲈体内7个foxo基因，并确定了其系统进化关系、基因和蛋白三维结构、保守domain和motif、组织分布以及应对短期饥饿处理时的表达模式。7个成员在进化过程中相对保守，均具有典型的Foxo蛋白三维结构和保守domain。组织分布结果显示foxos在小脑、下丘脑、端脑和中脑等中枢神经系统（CNS）中表现出较高的表达水平。在外周组织中，foxo1amRNA在花鲈肌肉中表达最高，其次是肠、胃和性腺。此外，肠和性腺中的foxo1b，性腺中的foxo3a和foxo6b，肌肉和性腺中的foxo3b和foxo4以及性腺、肠和胃中的foxo6a的表达水平相对较高。各个foxo基因的不同组织表达模式表明其潜在的生理功能存在差异。为了研究饥饿对花鲈foxo基因家族的影响，进行了短期饥饿实验，在不同饥饿时间点（0、1、6、12、24、48、72h）取花鲈的脑、肠、胃组织样品进行荧光定量PCR（qRT-PCR），结果表明：在饥饿期间，所有基因的表达量都随着饥饿时间的增加而变化，但只有foxo1a和npff在同一组织中具有相似的表达模式，而其他家族成员与npff没有这种相似的变化趋势，暗示foxo1a和npff可能存在功能上的相关性。 3.花鲈Foxo1a调控npff转录的分子机制研究 上述结果表明Foxo1a和NPFF在摄食调控中具有较强的联系。基于短期饥饿的研究结果，为了探究两者之间的关系，进行了原位杂交和双荧光素酶报告检测实验。在花鲈中脑的一些特定区域（如OTec和TL）和下丘脑的一些特定区域（包括与生殖调节相关的NDLI），与摄食调节相关的NAT、NLT、NVM中观察到大量的foxo1a阳性信号，这与npff在大脑中的定位结果一致。另一方面，foxo1amRNA在肠绒毛（IV）和肠固有层（LP）的上皮细胞（ECs）中表达较高，在胃上皮细胞（ECs）和胃腺（GG）中表达较高，这也与花鲈npff基因在胃肠中表达较高的结果相一致。因此，foxo1a和npff可能共同定位于花鲈大脑、胃和肠的相同细胞中，从而直接调控npff的转录。为了进一步证实Foxo1a对npff的转录调控，通过克隆得到了长度为2074bp的npff启动子序列，在其中发现了13个Foxo1的潜在结合位点。这些预测的Foxo1结合位点在正链中具有与哺乳动物类似的核心序列“TGTT(T/G)”或在反链中具有“(A/C)AACA”的核心序列。Foxo1结合位点的缺失和突变实验证实了其对npff基因的直接调控作用。结果表明，npff启动子上游-302bp和-56bp位点之间的两个Foxo1结合位点对花鲈npff的转录调控至关重要。本研究结果表明Foxo1a是花鲈npff启动子的转录激活因子，为Foxo1调节脊椎动物摄食过程的作用提供了新的视角。
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