摘要
烟曲霉是一种环境中广泛分布的条件致病真菌，它主要感染免疫缺陷的人群并引起侵袭性曲霉病。目前治疗曲霉病的一线药物主要是唑类药物。值得注意的是，由于医学和农业上唑类药物的广泛使用，在过去二十年里不断涌现出对唑类药物耐受的烟曲霉临床菌株，这给曲霉病的治疗带来了极大的挑战。因此，研究药物耐受的分子调控机制就显得尤为重要。烟曲霉耐药机制可被归为以下三类：1）药靶Erg11突变降低了其与药物的亲和力以及药靶Erg11的高调；2）药泵的高调来降低胞内药物滞留；3）逆境响应途径的激活引起的耐药。所以，研究药靶和药泵的表达调控对于理解烟曲霉的耐药机制至关重要。此外，烟曲霉抵抗氧化逆境的能力对于烟曲霉的生长发育以及适应宿主体内环境也是至关重要的。 本研究从药物逆境和氧化逆境两方面着手，利用转录组分析和生物信息学比对，筛选到了参与药物耐受的转录因子SltA（salttolerance）和参与抵抗氧化逆境的Sod1分子伴侣蛋白CcsA（copperchaperoneforSod1）并对它们的生物学功能进行了解析： 通过对添加药物处理前后烟曲霉样品转录组分析，本研究发现16个在mRNA水平上能够响应唑类药物刺激的转录因子，其中，只有敲除AFUB_041100表现出对唑类药物易感的表型，说明该基因对于烟曲霉响应唑类药物是必需的。生物信息学分析表明AFUB_041100编码SltA蛋白，是调节胞质钙平衡的C2H2型转录因子。在烟曲霉中，本研究也证实SltA通过负调节囊泡钙泵来维持胞质钙平衡。此外，敲除sltA对唑类药物敏感，高表达sltA对唑类药物耐受，说明SltA是参与药物耐受的正调节子。点突变和截断缺失实验表明SltA的DNA结合结构域和羧基端对于SltA介导的唑类药物耐受是必需的。转录组测序结合LacZ报告基因实验和凝胶迁移实验（EMSA）证实SltA可以直接结合启动子区保守的AGGCA序列并调控药靶Erg11A（Cyp51A）和药物外排泵蛋白Mdr1的表达。在sltA缺失菌中高表达erg11A和mdr1能够补救其唑类药物易感的表型。这些结果表明SltA是通过调控药靶Erg11A和药物外排泵Mdr1的表达来参与唑类药物耐受。重要的是，在耐药菌株中敲除sltA能够显著性降低其耐药程度，其原因是通过降低耐药菌株中erg11A和mdr1的表达来实现的。另外，大蜡螟感染模型实验表明SltA对于烟曲霉毒力也是必需的。 另一方面，烟曲霉中超氧化物歧化酶（SODs）在抵抗氧化逆境上发挥着重要的作用，包括Cu/Zn-SOD：Sod1以及Mn-SOD：Sod2和Sod3。虽然SOD的功能已被大家所熟知，但是它们的分子伴侣却知之甚少。本研究通过生物信息学分析发现CcsA是Sod1的分子伴侣蛋白。CcsA缺失导致烟曲霉在基本培养基上菌丝生长变慢，产孢减弱，说明CcsA在烟曲霉的营养生长和产孢方面发挥重要作用。此外，本研究发现，与野生型亲本菌株相比，CcsA缺失菌的Sod1酶活几乎完全丧失且活性氧（ROS）明显积累，表现出对氧化压力敏感的表型。这些结果说明CcsA可能是通过维持Sod1的酶活来参与抵抗氧化逆境的。点突变和免疫共沉淀实验（Co-IP）说明CcsA羧基端CXC结构域对于CcsA与Sod1的互作以及Sod1介导的氧化压力响应是必需的。总而言之，这些结果表明CcsA在烟曲霉中作为Sod1的分子伴侣来适应氧化压力。值得注意的是，高表达编码Mn-SOD的基因sod3能够补救ccsA和sod1缺失菌病态的表型，表明烟曲霉中Mn-SOD（Sod3）可以替代Cu/Zn-SOD（Sod1）的酶活性并可以缓解活性氧（ROS）的积累。 综上所述，本文不仅阐明了烟曲霉中C2H2转录因子SltA参与维持胞质钙平衡，这一点与模式真菌构巢曲霉中的结果是一致的。更为重要的是本研究发现SltA通过共调节药靶Erg11A和药泵Mdr1的表达来参与唑类药物耐受，提示可以通过针对抑制SltA来降低耐药株的耐药程度。此外，由于SltA是哺乳动物中缺失、维持烟曲霉毒力所必需的、真菌中独有的蛋白，SltA可以作为抗病原真菌的潜在药靶。另一方面，参与抵抗氧化逆境的Sod1分子伴侣蛋白CcsA通过与Sod1的互作来维持Sod1的酶活，进而参与氧化压力响应。本研究进一步拓宽了人们对于烟曲霉中药物逆境响应蛋白和氧化逆境响应蛋白的认知，为治疗由唑类药物耐受的菌株引起的曲霉病以及烟曲霉如何应对宿主氧化逆境方面提供了理论依据。
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