摘要
小麦是一种重要的粮食作物，为世界上超过三分之一人口的主粮作物。随着全球人口的增加，高产优质小麦的产出对于实现小麦农业生产的可持续发展以及保障国家的粮食安全具有重要意义。氮肥在小麦生产中扮演着重要的角色，对于小麦的增产贡献约为30%。但是，目前小麦的氮肥利用效率仅为33-50%，过量的氮肥施用不仅增加了农业投入，还造成了一系列的环境问题。因此，如何提高小麦氮效率（Nitrogenuseefficiency，NUE）成为一个重要的课题。培育氮高效的小麦品种是解决这一问题的重要途径。为育成氮高效的小麦品种，需要深入了解小麦氮吸收利用的遗传及分子机制。本研究首先通过Meta分析，发现编码转运蛋白的基因在影响作物产量及NUE中的作用相比其他基因更为突出。因此，本研究对小麦基因组内可能编码硝酸盐转运蛋白（Nitratetransporter，NRT）的基因家族进行了深入分析。同时，利用候选基因关联分析定位到了显著影响小麦氮效率的目的基因TaNRT2.1-6B，在此基础上，本研究通过非洲爪蟾卵母细胞异源表达体系验证了其硝酸盐转运活性，通过拟南芥突变体回补试验以及小麦基因过表达试验，深入解析了TaNRT2.1-6B在调控植物氮吸收利用过程中的重要作用。本研究的主要结果如下： 1.通过Meta分析，发现转基因技术可以显著提高小麦、玉米和水稻等3大粮食作物的产量、地上部生物量、氮吸收效率（Nitrogenuptakeefficiency，NUpE）和氮肥偏生产力（Partialfactorproductivityofnitrogen，PFPN），提高程度分别为16.7%、10.1%、16.2%和9.5%，但降低了作物的地上部氮利用效率（Shootnitrogenutilizationefficiency，SNUE）和籽粒氮利用效率（Grainnitrogenutilizationefficiency，GNUE），分别降低了6.6%和5.0%。与其他基因类型相比，编码转运蛋白的基因在提高作物产量和NUE方面的作用更加突出，对作物的产量、NUpE和PFPN分别提高了36.7%、46.1%和32.4%。转基因技术在提高作物NUE方面的效果因作物种类以及试验条件的不同而有明显差异，对水稻的产量增加最为明显，增产20.4%；盆栽条件下对作物产量和NUpE增加最为明显，分别增加了36.7%和26.8%。但基因超表达和异位表达在影响作物NUE方面无显著差异。基因超表达程度与作物NUE的提高之间无显著相关性。 2.对小麦基因组内的NPF（Nitratetransporter1andpeptidetransporterfamily）基因家族和NRT2基因家族进行了深入分析，发现小麦基因组内存在331个NPF基因及46个NRT2基因，NPF基因主要分布在2A、2B、2D、3A、3B、3D、7A、7B和7D染色体上，主要分布在染色体的R2b区域；NRT2基因主要分布在6A、6B和6D染色体上，主要分布在染色体的R1区域；串联重复是NRT2基因在小麦基因组扩展的主要因素；分别有41和91个NPF基因与拟南芥和水稻基因组NPF基因存在共线性；有6个NRT2基因与水稻的NRT2基因存在共线性；通过加权基因共表达网络分析（Weightedgenecoexpressionnetworkanalysis，WGCNA）发现多个转录因子家族（bHLH、WRKY、MYB、NAC、bZIP、GRAS等）与NPF基因或者NRT2基因共表达；非洲爪蟾卵母细胞异源表达试验发现，选定的2个NPF基因及1个NRT2基因可以在0.5mM或10mM硝酸盐浓度下转运硝酸盐；通过基因进化分析发现NPF基因和NRT2基因的自然突变可以显著影响小麦氮效率相关性状，NPF基因和NRT2基因的多态性主要是由于基因的随机漂变引起的，而不是育种选择。 3.以291个小麦品种的6个NUE相关性状与46个NRT2基因相关的170个单核苷酸多态性（Singlenucleotidepolymorphism，SNP）数据进行候选基因关联分析，共得到4个显著关联的NRT2基因。基因TraesCS6B02G044300（TaNRT2.1-6B）与6个性状中的4个性状均显著关联，且该基因的不同单倍型显著影响了小麦的产量及NUE性状。亚细胞定位试验发现TaNRT2.1-6B主要在细胞质膜上表达；非洲爪蟾卵母细胞异源表达试验发现该基因在0.25mM和10mM硝酸盐浓度下均能转运硝酸盐，进一步通过硝酸盐吸收动力学试验发现该基因是一个双亲和硝酸盐转运蛋白，低氮和高氮条件下的Km值分别为0.36±0.13mM和20.52±3.26mM。在拟南芥atnrt1.1突变体中回补该基因，明显改善了拟南芥根系生长及15N累积量；在小麦中过表达该基因，改善了苗期小麦的根系生长、15N累积量及吸收速率，提高了不同氮环境条件下小麦成熟期的产量、根系干重、地上部干重、根系氮累积量及籽粒氮累积量；提高了低氮条件下小麦的氮收获指数、籽粒氮利用效率和地上部氮利用效率。 4.通过烟草瞬时表达发现TaNRT2.1-6B的上游160bp以内存在影响启动子活性的重要元件，在上游1000bp到3000bp以内可能存在沉默子等元件影响启动子活性。通过反向ChIP（ChromatinImmunoprecipitation）及酵母单杂交试验发现组蛋白、甲基化酶、蛋白激酶、TCP转录因子、bHLH转录因子及GRAS转录因子等可能影响着TaNRT2.1-6B的表达。 综上所述，与其他基因类型相比，转运蛋白对作物产量及NUE相关性状影响更显著；在小麦基因组内存在331个NPF基因和46个NRT2基因，NPF基因和NRT2基因的自然变异显著影响着小麦的产量及NUE相关性状；TaNRT2.1-6B是小麦基因组内一个双亲和硝酸盐转运蛋白，过表达该基因对于提高小麦的产量及NUE具有重要作用。GRAS转录因子（TraesCS2D02G198200）可能是一个潜在的影响TaNRT2.1-6B表达的转录因子。
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