摘要
核酸作为遗传信息的载体，是生物体中最重要的生物分子之一。在所有生物细胞中几乎都发现了核酸的存在。近年来，随着市场上功能性核酸食品、核酸婴儿奶粉、以及转基因食品的出现，膳食核酸的消化吸收引起了人们的极大兴趣。本研究团队近期发现胃蛋白酶也是重要的核酸酶，这是一个改变教课书的新发现，因为传统理论认为核酸的消化始于小肠。然而核酸与胃蛋白酶在胃液中均为负电大分子，胃蛋白酶对核酸的消化机制研究尚不明确，膳食核酸在食品中的生物利用程度和机理的研究也较为缺乏。 基于以上问题，本文在体外模拟胃液中，通过研究不同长度的DNA与胃蛋白酶的结合情况，深入探究两个负电大分子胃蛋白酶与核酸的结合机制。并从实际摄食角度，研究了添加聚阴/阳离子海洋多糖对胃蛋白酶消化核酸的影响，从分子水平上阐释了胃蛋白酶、核酸和聚阴/阳离子多糖之间的相互作用。主要研究内容和结果如下： 首先，深入研究了胃蛋白酶对核酸本身降解的机理。研究了不同长度的DNA与胃蛋白酶的结合情况。结合鲑鱼精DNA后，胃蛋白酶的同步荧光光谱和三维荧光光谱出现红移，说明胃蛋白酶色氨酸残基周围疏水性增加，即胃蛋白酶构象更为松弛。不同长度的DNA（10nt、20nt、30nt、40nt、50nt）均能够与胃蛋白酶结合，在低DNA浓度时，其对胃蛋白酶的猝灭率随着DNA长度的增加而增大，即DNA长度能够极大的影响结合。而当DNA浓度足够高时，各种长度的DNA寡核苷酸，对胃蛋白酶的荧光猝灭率几乎相同（85-88%）。通过计算不同温度下DNA与胃蛋白酶的结合位点与作用力发现，30nt和10ntDNA与胃蛋白酶均只有一个结合位点，DNA与胃蛋白酶通过疏水相互作用结合。 其次，在体外模拟胃液下，研究了聚阴离子多糖对胃蛋白酶消化核酸的影响。结果表明，聚阴离子多糖硫酸葡聚糖（dextransulfate,DS）、岩藻多糖（fucoidan,FUC）、硫酸软骨素（chondroitinsulfate,CS）和海藻酸钠（sodiumalginate,ALG）均可以剂量依赖性抑制胃蛋白酶对DNA的消化，抑制能力为DSgt;FUCgt;CSgt;ALG。而组成这些多糖的单糖—葡萄糖、岩藻糖、甘露糖醛酸钠和古洛糖醛酸钠与DNA质量比为0.05:1-240:1时，对胃蛋白酶消化核酸无影响；硫酸软骨素二糖与DNA质量比≥160:1时，能抑制核酸的消化。分子量为40000的DS对胃蛋白酶消化核酸的抑制能力强于分子量为3000的DS，表明聚阴离子多糖的分子量越大，抑制能力越强。对胃蛋白酶的蛋白酶活力影响实验表明，聚阴离子多糖也能抑制胃蛋白酶对蛋白质的消化，荧光光谱证明，聚阴离子多糖可与胃蛋白酶结合。DS、FUC和CS同样能抑制酸性核酸酶DNaseII对核酸的消化。透射电镜（transmissionelectronmicroscopy,TEM）证实多糖可与DNA相互作用，猜测这是聚阴离子多糖抑制胃蛋白酶和DNaseII消化DNA的主要原因。另外，DS甚至可以在中性条件下抑制DNaseI对DNA的消化。结果表明，在食用富含聚阴离子多糖的食物时，应重新评估DNA的消化率。 最后，研究了聚阳离子多糖对胃蛋白酶消化核酸的影响。电泳结果显示，当壳聚糖与DNA质量比为0.5:1时，即可完全抑制胃蛋白酶对核酸的消化，且多糖浓度越高，抑制作用越强。荧光光谱显示，壳聚糖能够阻碍DNA与胃蛋白酶的结合。此外，壳聚糖的酶解产物壳寡糖与DNA的质量比≥5:1时，也能抑制胃蛋白酶对核酸的消化。而组成壳聚糖的单糖氨基葡萄糖和N-乙酰葡糖胺与DNA质量比在1:1-240:1时，对核酸的消化无抑制作用，且这两种单糖对DNA与胃蛋白酶的结合无显著影响。结果表明，壳聚糖/壳寡糖与DNA通过静电相互作用形成复合物，阻碍了DNA与胃蛋白酶结合，保护DNA免受胃蛋白酶降解。 总之，本研究通过荧光光谱、TEM、核酸电泳成像等技术手段和外加聚阴/阳离子多糖的方法，深入探究了胃蛋白酶对膳食核酸消化的机理，完善了膳食核酸在胃中消化的理论。本研究补充了海洋多糖的抗营养特性，为聚阴离子多糖用作基因载体提供理论依据，并提示了聚阴/阳离子多糖用于辅助治疗尿酸代谢异常可能的前景。
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