摘要
贝类增养殖在国内外水产养殖业中都占有重要地位，三倍体贝类以其生长快、个体大、糖原含量高、繁殖季节肥满度高、死亡率低等优点，具有极高的生产应用价值。近年来，低盐诱导三倍体由于具有诱导率高、操作简便、无毒无害、成本低廉等优点，已在诸多海产经济贝类中开展了研究。然而，低盐诱导分子机理的相关探究工作尚未见报道。 本研究以长牡蛎为实验材料，利用概率加权回归和主成分分析为低盐诱导的最佳诱导盐度提供了一种更为科学、全面的综合评价方法；探究了低盐诱导对长牡蛎受精卵胚胎发育及氧化应激、能量供应、渗透调节的影响；基于转录组与蛋白组的方法综合分析了低盐诱导过程中牡蛎受精卵基因与蛋白的差异表达，从分子层面上解释了低盐处理组死亡率高、发育迟缓的可能原因，并为进一步探究低盐诱导的分子机理提供了候选基因、蛋白、信号通路；根据转录组与蛋白组的结果，以微管蛋白为研究对象，探究了低盐处理过程中微管骨架的动态改变，分析了其在三倍体诱导过程中发挥的重要作用。主要研究结果如下： 1.利用概率加权回归拟合分别构建了低盐诱导三倍体过程中卵裂率、孵化率与诱导盐度的Probit回归模型，得到了不同诱导盐度条件下卵裂率及孵化率的估计值，并对该模型的可信性进行了验证。回归模型分别为：PROBIT（p，卵裂率）=-1.578+2.099×盐度以10为底转换后的对数值；PROBIT（p，孵化率）=-0.851+0.098×盐度。50%卵裂率及50%孵化率对应的诱导盐度估计值分别为5.648和8.644。同时，应用主成分分析得到了两个分别代表卵裂率/孵化率和三倍体率的主成分；计算了不同诱导盐度的综合评价指数，其中盐度8得分最高，为0.67，其次为盐度10，得分为0.54。综上，要达到50%孵化率，诱导盐度需要大于8.644，同时，盐度8和10均为合适的诱导盐度，其中盐度8诱导率更高、存活率较低，盐度10存活率更高而诱导率稍低，生产实践中可根据对诱导率和孵化率的不同需求选择合适的诱导盐度。 2.观察记录了低盐诱导后处理组和对照组到达不同发育时期所用的时间，测定了受精卵抗氧化、能量代谢和渗透调节相关酶的变化。结果显示，在40%-50%受精卵出现第一极体时用盐度4~12的低盐海水处理长牡蛎受精卵15min会导致其胚胎发育明显迟缓，且诱导盐度越低，发育速度越慢，最慢（盐度4）比对照组（盐度32）到达D形幼虫的时间滞后了4h以上。同时，用盐度8处理15min后，受精卵丙酮酸激酶（pyruvatekinase,PK）和Na+-K+-ATP酶水平显著降低、总抗氧化能力（T-AOC）水平显著升高（Plt;0.05）、谷草转氨酶（glutamicoxalacetictransaminase,GOT）水平无显著变化（Pgt;0.05）；转入自然海水中恢复1.5h后，四细胞期胚胎丙酮酸激酶、Na+-K+-ATP酶及总抗氧化能力（total-antioxidantcapacity，T-AOC）水平均恢复到与对照组无显著差异，而谷草转氨酶水平仍无明显改变，说明低盐胁迫会导致长牡蛎受精卵糖代谢受阻，渗透调节紊乱，同时受到较严重的氧化胁迫，且这些改变在转入自然海水一定时间后即可恢复，不会对胚胎发育产生持续性影响，而GOT的表达水平则始终没有明显变化。本研究表明低盐诱导不仅会导致牡蛎受精卵胚胎发育迟缓，还会使其受到严重的氧化胁迫，同时阻碍其代谢供能及渗透调节。 3.利用RNA-seq技术综合分析了低盐诱导牡蛎三倍体过程中受精卵的转录后表达情况。150bp双端测序共得到326million的rawreads，从头拼接后获得了26965条unigene，平均长度为934bp，N50为1721bp。处理组与对照组间共检测到3024个差异表达基因，其中2501个基因的表达量发生了显著上调，另外523个差异基因的表达量发生了下调。GO注释和KEGG通路富集分析结果表明差异基因主要参与了渗透调节、细胞骨架、细胞凋亡/存活等众多生物学过程，说明它们在细胞增殖和胚胎发育的过程中发挥着重要的调控作用，可以作为进一步研究低盐诱导机制的候选基因和途径。 4.利用iTRAQ技术对牡蛎受精卵低渗诱导过程中的蛋白组改变进行了探究。共鉴定到了2235个蛋白，其中87个的蛋白表达量发生了显著改变，14个差异蛋白的表达量增加，69个蛋白的表达量减少。采用PRM分析检测了差异蛋白的表达水平，对蛋白组的结果进行了验证。结果显示，ADP核糖化因子、DNA修复蛋白Rad50、剪接因子3B、微管蛋白分子伴侣D等诸多功能蛋白的表达量发生了显著变化，它们参与了能量代谢、囊泡运输、细胞骨架修饰和DNA/RNA/蛋白质合成代谢等生物学过程，对细胞分裂和胚胎发育具有重要的调控作用。本研究不仅从蛋白改变的角度分析了低盐处理组幼虫孵化率低、死亡率高的可能原因，也为进一步探究低渗诱导的分子机制提供了有价值的基础。 5.探究了不同诱导盐度（S=4、8、12）、诱导时长（5min、10min、15min、20min）及诱导后转入自然海水恢复一定时间（5min、15min、30min、1h、2h）对受精卵微管蛋白聚合及乙酰化的影响。结果显示，低盐处理后微管蛋白总量无显著变化，随盐度胁迫加强、处理时间延长，溶解态微管蛋白占总微管蛋白的比例逐渐增加，α-微管蛋白乙酰化水平逐渐降低。这一结果表明，低渗诱导后，微管由聚合态向溶解态转变，有解聚倾向，且其解聚水平与盐度胁迫水平正相关；转入自然海水中5min后微管聚合与乙酰化水平即开始恢复，说明低盐对微管的影响是是暂时的、可恢复的。微管的解聚会严重影响纺锤体的正常组装，导致染色体异常分离，这可能是低渗诱导贝类三倍体的重要原因之一。
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