摘要
双酚S(bisphenolS,BPS)是双酚A(bisphenolA,BPA)的替代物，虽比BPA具有更好的热稳定性和光稳定性，但也已在环境以及人体体液样本中广泛检出，且检出浓度和检出频率已接近甚至高于BPA。BPS虽具有低毒性，但仍具有肝肾毒性、遗传毒性、生殖发育毒性和内分泌干扰效应。而且，已有研究表明，BPS通过与雌激素受体(estrogenreceptoralpha,ERα)结合，以ERα激动剂的方式促进乳腺癌细胞MCF-7细胞增殖，但具体机制尚未完全阐明。为此，本研究采用差异表达ERα和G蛋白偶联受体30(Gprotein-coupledreceptor30,alsoknownasGprotein-coupledestrogenreceptor1,GPER)的MCF-7、MDA-MB-231和SK-BR-33种乳腺癌细胞系作为实验材料，研究了ERα和GPR30在BPS诱导的乳腺癌细胞增殖和抑制细胞凋亡中的作用，提出BPS通过ERα-cyclinD-CDK4/6-Rb通路加快MCF-7细胞周期，并抑制线粒体起始的内源细胞凋亡途径，从而促进其细胞增殖。本文研究结果如下： 1)10-10~10-4MBPS暴露MCF-7(ERα+)细胞6d，1~100μMBPS以剂量依赖的方式促进细胞增殖，其中10μMBPS增殖效果最显著。所有暴露浓度的BPS均不能促进ERα-的MDA-MB-231和SK-BR-3细胞增殖。5nMICI182,780(ERα/β拮抗剂)、100nMMPP(ERα拮抗剂)或100nMPD0332991(cyclinD-CDK4/6拮抗剂)与10μMBPS联合暴露时，均可阻断BPS诱导的细胞增殖，而100nMG15(GPR30拮抗剂)对BPS诱导的细胞增殖无显著影响。10μMBPS暴露MCF-7细胞24h，对ERαmRNA和蛋白表达无显著影响，但是显著上调了ERα下游靶基因孕激素受体(progesteronereceptor,PR)的mRNA和蛋白表达。而且，BPS诱导的PR蛋白表达上调和细胞增殖，能被ICI182,780和MPP所阻断，不能被G15所阻断。利用荧光探针Fluo-4AM对细胞质中Ca2+水平进行检测，结果发现10μMBPS暴露MCF-7细胞120s，对Ca2+动员无显著影响。Westernblotting结果也表明，BPS暴露MCF-7细胞0~90min，对细胞中p-Akt(Ser473)水平无显著影响。由此推断，BPS诱导的MCF-7细胞增殖依赖于ERα，而GPR30介导的非基因组信号通路并未发挥关键作用。 2)流式细胞周期检测结果表明，经无血清饥饿培养24h的MCF-7细胞，86%的细胞被阻滞在G0/G1期，细胞被同步化。10μMBPS暴露MCF-7细胞24h后，显著降低G0/G1期细胞比例，提高S期比例，而1和10μMBPS暴露ERα-的MDA-MB-231和SK-BR-3细胞，对其细胞周期无显著影响。10nMICI182,780、100nMMPP或100nMPD0332991与10μMBPS联合暴露时，均可阻断BPS诱导的S期上调，而100nMG15对S期细胞比例无显著影响。上述结果表明BPS通过ERα依赖的方式加快MCF-7的细胞周期，促进其细胞增殖。 10μMBPS暴露以时间依赖方式促进MCF-7细胞中Rb的磷酸化，30-90min后p-Rb(Ser807/811)水平均显著高于对照组。ICI182,780、MPP和PD0332991与BPS联合暴露时，均可阻断BPS对p-Rb水平的上调，而G15则不能阻断BPS对p-Rb水平的上调，而10μMBPS暴露则对SK-BR-3细胞p-Rb水平无显著影响，这表明BPS通过促进Rb的磷酸化，促进G1-S期转换，进而加快MCF-7的细胞周期。1和10μMBPS暴露显著上调了细胞周期蛋白cyclinD1(CCND1)、cyclinA2(CCNA2)和cyclinE2(CCNE2)mRNA的表达水平，还显著上调了转录因子E2F1(E2F1)mRNA的表达水平，下调了周期蛋白激酶抑制因子(CKIs)中p21(CDKN1A)mRNA的表达水平。同时，westernblotting检测结果也表明，BPS暴露显著上调了cyclinD1和cyclinE2的蛋白表达水平，而对cyclinA2和p21的蛋白表达无显著影响。而且，BPS诱导的cyclinD1(ERα的下游靶蛋白)上调能被ICI182,780或MPP完全阻断，而不能被PD0332991或G15阻断。这些研究结果表明，BPS诱导的p-Rb上调和细胞周期加快，依赖于ERα和cyclinD-CDK4/6。综上，BPS通过ERα-cyclinD-CDK4/6-pRb通路，加快乳腺癌细胞MCF-7的周期进程，促进细胞增殖。 3)AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测结果表明，无激素饥饿处理MCF-7细胞，显著引起早期细胞凋亡，而BPS暴露则显著降低了无激素饥饿诱导的MCF-7细胞凋亡。细胞计数和CCK8细胞活力检测结果也表明，与无激素饥饿处理组相比，10μMBPS暴露组的细胞活力显著升高，但细胞数目无显著变化，即BPS暴露显著抑制了无激素饥饿诱导的MCF-7细胞凋亡。无激素饥饿处理或BPS暴露MCF-7细胞，细胞中活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)水平均未发生显著改变，这表明ROS在无激素饥饿诱导的细胞凋亡和BPS抑制的细胞凋亡中并未起主导作用。Caspase酶活检测结果表明，BPS暴露对主导外源途径的caspase-8活性未产生显著改变，但显著下调了主导线粒体途径的caspase-9酶活性。而且，荧光探针JC-1检测结果也表明，无激素饥饿处理显著下调了MCF-7细胞中线粒体膜电位，而BPS暴露则显著抑制了无激素饥饿诱导的线粒体膜电位下调。上述结果表明，BPS可能是通过抑制线粒体起始的内源途径，从而抑制细胞凋亡。 10μMBPS暴露未显著影响MCF-7细胞中Bax(BAX)mRNA的表达水平，但显著上调了Bcl-2(BCL-2)mRNA水平，下调了Bik(BIK)mRNA水平。同时，BPS诱导的Bcl-2(BCL-2)mRNA水平上调和Bik(BIK)mRNA水平下调能被10nMICI182,780或100nMMPP完全阻断，而不能被100nMG15阻断。而且，10nMICI182,780或100nMMPP与10μMBPS联合暴露时均可阻断BPS抑制的细胞凋亡，而100nMG15则无效。由此推测，BPS以ERα依赖的方式，上调Bcl-2以及降低Bik的基因表达，减少线粒体膜通透性和caspase-9酶活性，从而抑制了MCF-7细胞凋亡。 综上所述，本研究从加快细胞周期和抑制细胞凋亡两大方面探讨BPS促乳腺癌细胞增殖的机制，以期为外源雌激素促乳腺癌细胞增殖的机制研究提供新的思路。
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