摘要
群体感应（QuorumSensing，QS）是细菌密度达到一定数量时细菌之间相互交流的现象，目前已经证实细菌的群体感应与食品的腐败变质密切相关。希瓦氏菌是冷藏水产品常见的腐败菌，其群体感应系统已成为水产品腐败调控的新靶点。希瓦氏菌群体感应系统复杂，其中LuxR系统对希瓦氏菌致腐能力的发挥有着重要作用，但其机制尚不清楚，需要深入研究。 本文以冷藏凡纳滨对虾特定腐败菌希瓦氏菌(Shewanellabaltica)为研究对象，通过基因敲除手段构建希瓦氏菌luxR2突变菌株，探究外源添加AHLs对希瓦氏菌的体外培养及生长代谢的影响；通过反接种实验研究冷藏凡纳滨对虾贮藏过程中的QS窃听现象，研究希瓦氏菌LuxR2介导的QS对冷藏凡纳滨对虾贮藏过程中的菌相演变和腐败进程的影响，探究希瓦氏菌的致腐机制。主要研究结果如下： 1.希瓦氏菌luxR2基因缺陷株的构建及其功能研究。依据PCR融合和基因重组原理，构建了冷藏凡纳滨对虾特定腐败菌希瓦氏菌SA03的luxR2缺陷菌株。外源添加C6-HSL，体外培养野生型希瓦氏菌和luxR2缺陷型希瓦氏菌，检测其生长代谢指标。实验结果表明，希瓦氏菌SA03通过luxR2基因感受外源C6-HSL信号分子，进而通过QS系统提高其生长速率。luxR2基因与希瓦氏菌产硫能力有关，野生型希瓦氏菌产硫能力明显高于luxR2缺陷型希瓦氏菌。此外，luxR2基因可以调控希瓦氏菌某些蛋白的表达，进而影响其生长代谢及功能。 2.希瓦氏菌LuxR2系统对冷藏凡纳滨对虾菌相演变及腐败进程的影响研究。以含有野生型希瓦氏菌或luxR2缺陷型希瓦氏菌的初始菌相反接种凡纳滨对虾，通过测定细菌生长速率、细菌延滞期、细菌总数及挥发性盐基氮（TVB-N）含量，探究希瓦氏菌LuxR2系统对希瓦氏菌致腐能力的影响。结果表明，希瓦氏菌luxR2基因可以显著提高冷藏凡纳滨对虾贮藏过程中细菌的最大生长速率，缩短细菌生长延滞期。在培养144h后，luxR2缺陷型希瓦氏菌的细菌延滞期为88±4h，比野生型希瓦氏菌延长了138%，两者之间差异显著(Plt;0.05)。在凡纳滨对虾冷藏过程中，接种luxR2缺陷型希瓦氏菌后，凡纳滨对虾样品的细菌总数、TVB-N含量均显著低于野生型希瓦氏菌处理组(Plt;0.05)。贮藏第6d，接种luxR2缺陷型希瓦氏菌的处理组的细菌总数和TVB-N值分别为81×105cfu/g和43.08±1.03mg/100g，分别比野生型希瓦氏菌处理组低38.7%和17.1%，差异达显著水平(Plt;0.05)。该结果表明希瓦氏菌LuxR系统介导的群体感应对其致腐能力影响显著。 3.希瓦氏菌LuxR系统介导的群体感应窃听对其致腐能力的影响研究。利用希瓦氏菌不产生AHLs信号分子，但能通过LuxR系统感受其他细菌产生的外源信号分子，将希瓦氏菌与不动杆菌共培养，测定共培养过程中细菌的生长、生物膜及胞外酶变化情况，探究LuxR系统介导的群体感应窃听对希瓦氏菌致腐机制的影响。结果表明，野生型希瓦氏菌与不动杆菌之间存在QS窃听现象，在与不动杆菌共培养过程中，野生型希瓦氏菌的生长速率与luxR2缺陷型希瓦氏菌相比明显提高；同时，共培养过程中，野生型希瓦氏菌蛋白酶活力比希瓦氏菌单独培养时降低了14.8%，luxR2缺陷型希瓦氏菌比单独培养时降低了10.3%；添加50%不动杆菌上清液共培养时，野生型希瓦氏菌蛋白酶活力降低了62.4%，luxR2缺陷型希瓦氏菌比单独培养时提高了7%，差异达显著水平(Plt;0.05)。表明luxR2基因能够调控希瓦氏菌SA03窃听不动杆菌产生的AHLs，提升自身的生长速率，降低蛋白酶活力。反接种实验进一步证实，野生型希瓦氏菌共培养组的细菌总数、TVB-N含量显著高于luxR2缺陷型希瓦氏菌处理组。表明luxR2基因可通过调控希瓦氏菌LuxR系统介导的群体感应窃听，提升其致腐能力，从而加速冷藏凡纳滨对虾的腐败进程，缩短货架期。
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