摘要
戊型肝炎病毒（HepatitisEvirus，HEV）是引起急慢性肝炎的主要病原之一，在世界范围内每年造成约5万人死亡。戊型肝炎在孕妇中的致死率高达25%，并且HEV在器官移植病人和免疫缺陷患者中会发生持续性感染。限制HEV研究的主要因素是缺乏有效的体外培养体系和持续感染的小动物模型。本研究建立了稳定表达绿色荧光蛋白的p6-EGFP/Zeocin（p6-EZ）HEV复制子细胞系和基因3型人源HEV蒙古长爪沙鼠感染模型。 目前，HEV缺乏良好的细胞培养系统，因此需要建立病毒复制子细胞模型来模拟HEV在细胞中的持续性感染，并利用该模型研究HEV发病的分子机制等。本研究建立了基因3型HEVRNA复制子细胞模型，在HEV复制子细胞模型中含有表达EGFPZeocin（EZ）基因的HEVRNA复制子。通过将体外转录获得的HEV复制子RNA转染至细胞中，在Zeocin抗生素筛选下，HEV复制子可以在人类肝癌细胞（Huh-7-S10-3）或仓鼠鼠肾细胞（BHK-21）中持续自我复制。在Zeocin抗生素筛选下，S10-3-EZ和BHK-21-EZ两个细胞系可以连续传代并稳定表达HEV复制子p6-EZ。实验结果显示，HEV的基因组、亚基因组RNA和非结构蛋白ORF1均在HEV复制子细胞中稳定表达。利用HEV复制子细胞模型，本研究证明HEV感染能够抑制I型干扰素通路的激活，表现为降低IRF3磷酸化的水平，表明HEV的持续性感染会抑制细胞天然免疫的应答。本研究进一步证明，干扰素（IFN-α）或利巴韦林可以显著降低复制子细胞系中HEVRNA的拷贝数，且呈剂量依赖性。以上结果进一步证明该细胞模型在研究HEV抗病毒药物和HEV与Ⅰ型IFN信号通路互作中的应用价值。 接下来本研究建立了人基因3型戊型肝炎病毒沙鼠感染模型，并对基因1型和4型戊型肝炎病毒感染沙鼠进行了回顾性研究。并进一步证实HEV沙鼠感染模型在抗病毒药物药效评价、天然免疫RNA识别和病毒与Ⅰ型IFN信号通路互作研究中的应用价值。 本研究分别通过肝内接种“加帽”全长HEVRNA、灌胃接种HEV活病毒或腹腔接种HEV活病毒的方式对沙鼠进行感染。在沙鼠肝脏、胆汁和脾脏中均检测到了HEVRNA的存在，病毒感染持续时间长达7周，检测到HEV感染导致沙鼠肝脏损伤，并在血清中检测到HEV-IgG抗体。本研究利用HEV沙鼠感染模型对PEG-IFNα-2a和利巴韦林治疗HEV感染的有效性进行了评价。同时利用HEV沙鼠感染模型检测了模式识别受体-干扰素系统通路（PRR-interferonsignaling）在体内对病毒复制的影响。当使用两种靶向抑制TBK1的小分子药物（BX795和MRT67307）时，HEV在沙鼠中的复制明显增强。该动物模型的建立将促进HEV特异性抗病毒药物和体内HEV感染与宿主天然免疫互作机制的研究。 最后，本研究利用HEV复制子细胞系对小分子抑制剂库进行筛选，发现小分子抑制剂库中17种HSP90的抑制剂均能有效抑制HEV的复制，其疗效显著优于传统抗病毒药物。HSP90小分子抑制剂使ORF1从ORF1-HSP90复合物中释放出来，并迅速降解。实验结果表明，靶向抑制ORF1-HSP90相互作用的治疗HEV感染策略是安全有效的，并且减轻了HEV感染引起的沙鼠肝损伤。 本研究建立了基因3型HEV复制子细胞系统和沙鼠感染模型，发现HSP90是支持HEV复制的关键宿主因子，并提出了一种可行的HEV治疗策略。有助于HEV持续性感染分子机制及抗HEV药物的进一步研究。
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