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新型CRISPR/SpCas9-hRedβ基因编辑系统的构建及验证
马锦荣1
作者信息
摘要
CRISPR基因编辑技术因其设计简单、活性高、可以满足大多数基因区域的编辑需求而广受青睐。基于CRISPR技术的动物基因编辑育种更是近年的研究热点。CRISPR/Cas9系统由于开发最早、活性较高和适用范围广等优势，在科学研究中的应用最为普遍。目前研究工作者们已经开发出了多种多样的CRISPR/Cas9改进系统，极大的丰富了CRISPR基因编辑技术体系。其中，将功能性蛋白与Cas9蛋白融合表达以强化或拓展其功能是一种普遍且有效的改进策略。 本研究将密码子人源化优化的噬菌体单链退火蛋白基因hRedβ引入CRISPR/SpCas9系统，构建了新型的CRISPR/SpCas9-hRedβ基因编辑系统，并进行了系统的基因编辑功能验证。主要研究结果如下： （1）首先合成密码子人源化优化的hRedβ基因，构建相应的表达载体；将hRedβ和CRISPR/SpCas9表达载体与基于NHEJ或SSA修复的报告载体（NHEJ-PG/SSA-PG）报告载体共转染HEK293T细胞，检测hRedβ与SpCas9共表达对基因编辑效果的影响。结果表明，hRedβ与SpCas9共表达能有效提高20%的NHEJ修复效率、1.4倍的SSA修复效率。 （2）进一步针对基因组EMX1位点，将hRedβ和CRISPR/SpCas9表达载体与供体DNA模板共转染HEK293T细胞，检测分析基因组EMX1靶点的NHEJ和HDR编辑效率。结果与报告载体水平相似，hRedβ与SpCas9共表达组的NHEJ编辑效率提高了约1.7倍，而HDR编辑效率则降低了29%。 （3）采用hRedβ-MHGGS-SpCas9、hRedβ-XTEN-SpCas9和SpCas9-hRedβ三种不同的融合表达策略，将hRedβ与SpCas9融合表达，建立CRISPR/SpCas9-hRedβ基因编辑系统。基因编辑试验验证结果表明，三种融合表达策略均能不同程度地提高CRISPR/SpCas9系统介导的NHEJ编辑效率，其中hSpCas9-hRedβ介导的NHEJ编辑效率是SpCas9的3.6倍。 综上所述，本研究建立了一种能够提高NHEJ编辑效率的CRISPR/SpCas9-hRedβ基因编辑系统，为基因编辑研究中低效率位点的编辑提供了新的工具，进一步丰富了CRISPR基因编辑技术手段。
关键词
基因编辑/非同源末端链接/Redβ蛋白/CRISPR/SpCas9系统/CRISPR/Cas9系统引用本文复制引用
授予学位
硕士学科专业
动物遗传育种与繁殖导师
张智英学位年度
2021学位授予单位
西北农林科技大学语种
中文中图分类号
Q7