摘要
条斑紫菜是我国重要的养殖海藻，具有极高的营养价值和经济价值，随着养殖规模的扩大，病害问题日益严重，其中赤腐病是最为严重的病害之一。目前对于赤腐病尚无有效的防治措施，一旦爆发，极易造成减产甚至绝收。培育抗病品系是防治赤腐病的理想手段，而了解条斑紫菜对赤腐病感染的响应（先天免疫机制）是实现抗赤腐病品系高效选育的关键。为揭示条斑紫菜对赤腐病感染的响应机制，利用转录组技术，分析条斑紫菜基因在感染紫菜腐霉前后转录水平的变化，筛选免疫相关基因，发现条斑紫菜中存在完整的先天免疫系统。利用多光谱荧光成像技术，从次级代谢和光合作用的变化入手，开发赤腐病早期无损检测技术。通过培养条斑紫菜赤腐病病斑中存活的健康单细胞得到抗赤腐病品系，并进行抗病力等级评级，测量部分生产性状，为生产实践提供优良品系。通过抗病品系和一般品系在感染前后转录组的比较，分析抗病品系抗赤腐病的机制，为条斑紫菜抗病品系的分子育种提供理论基础。主要研究结果如下： 1）条斑紫菜对紫菜腐霉感染的转录组响应 通过检测条斑紫菜感染前后光合作用的变化，实现对赤腐病感染过程的分期。采用转录组测序技术，筛选条斑紫菜感染紫菜腐霉不同感染时期的差异基因，分析条斑紫菜对紫菜腐霉的响应机制，建立以条斑紫菜为宿主的红藻---病原的相互作用模型。根据组织病理学、光合作用差异和转录组数据，将条斑紫菜感染赤腐病分为轻度感染期和重度感染期。条斑紫菜为防御紫菜腐霉，分泌纤维素酶降解紫菜腐霉细胞壁抑制其蔓延。降解细胞壁的过程产生多种寡糖，这些寡糖可以作为病原相关分子模式PAMPs被位于条斑紫菜细胞膜上C型凝集素识别，进一步激活下游PTI反应。条斑紫菜大量合成ROS，同时激活ROS消除机制，抑制病原，维持ROS平衡；上调次级代谢；合成酚类物质应对病原感染；分泌金属蛋白酶抑制剂，抑制病紫菜腐霉胞外金属蛋白酶活性；上调表达酪氨酸酶，产生醌抑制病原蔓延。在重度感染期，条斑紫菜通过HSP70、HSP90或假定R蛋白识别紫菜腐霉效应因子，激活ETI反应。显著上调泛素化-蛋白酶体途径，降解病原的入侵蛋白。激活细胞程序性死亡，抑制病原蔓延。 2）多光谱荧光成像技术在条斑紫菜赤腐病检测的应用 利用多光谱荧光成像技术，筛选可以用于条斑紫菜感染赤腐病进行早期无损检测的参数。从所有叶片的平均值来看，各特征性波峰的荧光光谱及其比值在条斑紫菜感染紫菜腐霉后的变化差异较大：激发荧光F440在感染第0-6天变化不大，仅在第8天发生显著上升；F520则从第3天开始持续升高，在第4-8天显著高于对照组；F690和F740具有相同的趋势，在第4天开始持续下降，且显著低于对照组。F440/F690直到感染的第7天才显著高于对照组，而F520/F690从第5天开始显著高于对照组且持续上升。根据以上结果，结合F520、F690和F520/F690在感染组同一个叶片不同感染时间的荧光成像效果，推荐可至少提前24h检测到感染点且成像效果好的F690作为早期无损检测中的参数。 3）条斑紫菜抗赤腐病品系的选育 采用直接培养病斑碎片的方法实现对病斑中存活细胞的培养，得到了13个潜在的抗病品系PyR21、PyR23---PyR34。在同一条件下分别测量13个品系受紫菜腐霉感染后的病斑蔓延速度v、病斑出现时间T、单个叶片上病斑数N和累积感染率P。实验发现，3个品系PyR21、PyR27、PyR23累积感染率显著低于原品系RZ，其他品系与RZ没有显著变化；4个品系PyR21、PyR27、PyR34、PyR30叶片平均病斑数显著低于原品系RZ，其他9个品系与RZ均无显著性差异；有7个品系（PyR27、PyR28、PyR25、PyR26、PyR21、PyR33、PyR23）病斑蔓延速度显著小于原品系RZ，有6个品系与原品系RZ没有显著性差异；2个品系PyR21和PyR27病斑出现的时间显著晚于原品系RZ，2个品系PyR24和PyR31显著早于原品系RZ；其余9个品系与RZ相比没有显著性差异。以上4个参数对于抗病力的评定一致性较差，我们采用主成分分析的方法，分别计算以上4个参数对于条斑紫菜抗病力的贡献度，得到抗病力指数公式：R=-1.94*v+2.17*T-0.67*N4-5.6*P5。使用该公式对抗病力进行评价，按抗病力指数的数值和各品系之间的显著性差异比较，将13个品系分为了高抗品系、中抗品系、一般品系，为研究紫菜抗赤腐病机制提供材料。对以上13个品系的单孢子释放能力和生长速率进行测定。综合抗病力指数、单孢子释放能力和生长速率，我们筛选得到了5个抗病力强、单孢子释放能力强和生长速率快的品系PyR21、PyR25、PyR28、PyR30、PyR32。 4）条斑紫菜抗赤腐病机制 通过抗赤腐病品系PyR27和一般品系RZ的比较转录组和WGCNA分析，得到了PyR27中的抗赤腐病机制。在感染第3天，R27通过上调表达病原识别受体PRRC-lectin和N-糖链的合成，高效识别紫菜腐霉；进而激活下游PTI反应，上调表达多种防御机制，包括胞外纤维素酶和H2O2合成。随着H2O2的累积，H2O2作为信号分子激活细胞程序性死亡。与R27相比，一般品系RZ对病原感染的响应较晚，无法在感染前期实现对病原的抑制。通过WGCNA分析，在R27中，过氧化物酶、NADPH氧化酶、泛素连接酶E3、凋亡因子metacaspase是参与感染第3天响应机制的核心基因，参与ROS合成、泛素化途径和细胞凋亡，使R27可以在感染第3天提高对紫菜腐霉的防御能力。
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