摘要
水产饲料中植物蛋白的过度添加会造成养殖鱼类生长性能下降及健康受损，而微生物发酵是缓解植物蛋白引起的负面影响并提高其利用率的有效方法。本文以我国重要海水经济养殖鱼类大菱鲆(ScophthalmusmaximusL.)为研究对象，评估了屎肠球菌（Enterococcusfaecium）发酵豆粕在大菱鲆饲料中的应用效果。本文从大菱鲆肠道粘膜中定向分离出了一株肠道共生菌希瓦氏菌MR-7（Shewanellasp.MR-7），并全面评估了其基因组结构和功能、生长特性、产酶能力及发酵特性。本文研究了Shewanellasp.MR-7发酵豆粕对大菱鲆生长性能和肠道健康的影响，并进一步研究了Shewanellasp.MR-7对LPS诱导的大菱鲆肠道功能障碍的修复机制。 1，豆粕及Enterococcusfaecium发酵豆粕替代鱼粉对大菱鲆生长、抗氧化能力及肠道健康的影响。 本研究比较了豆粕（SBM）和Enterococcusfaecium发酵豆粕（EFSM）替代鱼粉对大菱鲆生长、抗氧化状态、肠道菌群、组织形态学和炎症反应的影响。以鱼粉组为对照组（CONT），以SBM和EFSM分别替代饲料中45%的鱼粉作为实验组，制作3种等氮等能的饲料，饲喂初始体重7.57±0.01g的大菱鲆，养殖周期79天。结果表明：SBM组大菱鲆生长性能显著下降，EFSM组与对照组相比无显著差异。对照组大菱鲆血浆溶菌酶、补体C3、总抗氧化能力、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶值最高，EFSM组次之，SBM组最低。对照组大菱鲆血浆丙二醛含量最低，EFSM组次之，SBM组最高。肠道形态学结果显示，摄食SBM可引起典型的肠道炎症症状，包括后肠绒毛和微绒毛高度的降低、固有层宽度的增加和炎性细胞的浸润。而摄食EFSM明显减轻了肠道病理性的损伤。与形态学表型症状一致，SBM组大菱鲆后肠促炎细胞因子包括tnf-α、il-1β和il-8基因表达水平最高，EFSM组次之，对照组最低。此外，肠道菌群分析显示，相较于SBM组，EFSM组与对照组的菌群结构总体上更相似。相较于SBM组，摄食EFSM显著提升了益生菌Lactobacillus和抗炎菌Faecalibaculum的丰度，降低了Vibrio的丰度。本研究表明，Enterococcusfaecium发酵能通过增强大菱鲆的抗氧化能力、抑制炎症反应、调节肠道菌群，有效的抵消摄食豆粕产生的负面作用。 2，大菱鲆肠道共生菌Shewanellasp.MR-7的筛选、分离及特性研究 本研究采用IlluminaHiSeqXTen平台对Shewanellasp.MR-7进行了基因组扫描测序；以OD600为纵坐标，绘制了Shewanellasp.MR-7在不同温度及pH下的生长曲线；运用酶联免疫法评估了Shewanellasp.MR-7的产酶能力；采用单因素变量法，以酸溶蛋白产量为指标，优化了Shewanellasp.MR-7固态发酵豆粕的条件，并测定了豆粕营养品质的变化。结果表明：Shewanellasp.MR-7基因组总长4077231bp，包含4530个预测基因，G+C含量为48.88%。对3709个预测基因进行了COG注释，其中注释到了大量编码各种酶的基因。2482个预测基因参与40条KEGG通路，分别为“代谢”、“基因信息处理”、“细胞过程”、“环境信息处理”、“有机系统”等。与“代谢”相关的1223个基因中，190个基因参与碳水化合物代谢，189个基因参与氨基酸代谢。生长曲线测定结果表明Shewanellasp.MR-7的最适生长条件为37℃、pH6。在最适生长条件下，Shewanellasp.MR-7表现出了稳定的产蛋白酶（380.54±0.39U/L）、果胶酶（18.49±0.41U/L）、纤维素酶（39.11±1.23U/L）、半纤维素酶（93.86±0.72U/L）和植酸酶（14.80±0.40U/L）的能力。在温度37℃、pH为6的条件下，Shewanellasp.MR-7产蛋白酶活性最高。 以酸溶蛋白产量为评价指标，Shewanellasp.MR-7固态发酵豆粕的最适条件为发酵温度37℃、接种量10%、料水比1:1、发酵周期48h。在最适发酵条件下进行豆粕固态发酵，对豆粕发酵前后营养品质进行测定，结果表明：Shewanellasp.MR-7发酵显著提升了粗蛋白（+3.20%）和酸溶蛋白（+482.79%）含量，大幅降低了豆粕中的抗营养因子含量，包括大豆球蛋白（?77.36%）、β-伴大豆球蛋白（?84.52%）、胰蛋白酶抑制剂（?90.19%）、棉籽糖（?29.25%）和水苏糖（?24.25%）。综上结果表明，Shewanellasp.MR-7具有卓越的豆粕利用能力，通过发酵能大幅改善豆粕品质。 3，豆粕及Shewanellasp.MR-7发酵豆粕对大菱鲆生长、饲料利用及肠道健康的影响 本实验评估了摄食豆粕（SBM）和Shewanellasp.MR-7发酵豆粕（FSBM）对大菱鲆生长、饲料利用及肠道健康的影响。实验设计以鱼粉组（FM）为对照组，以SBM和FSBM分别替代15%（SBM15/FSBM15）、30%（SBM30/FSBM30）、45%（SBM45/FSBM45）和60%（SBM60/FSBM60）饲料中的鱼粉蛋白制作9种等氮等能的饲料，饲喂初始体重7.57±0.01g的大菱鲆，养殖周期79天。结果表明：SBM和FSBM分别能替代大菱鲆饲料中30%、45%的鱼粉蛋白而不影响大菱鲆的正常生长。与鱼粉组相比，SBM和FSBM替代水平分别超过30%和45%时，大菱鲆蛋白质效率、饲料效率及粗蛋白和干物质表观消化率均显著降低。同等替代水平下，FSBM组大菱鲆肠道胰蛋白酶、脂肪酶及淀粉酶活性均显著高于SBM组。随着SBM替代水平的提高，大菱鲆后肠绒毛数量及高度均显著降低，然而，FSBM组没有观察到明显的组织病理学的变化。同时，当SBM替代水平达到并超过30%时，大菱鲆后肠occludin基因表达水平显著降低，muc-2基因表达水平显著升高。SBM替代水平达到并超过45%时，zo-1和tricellulin基因表达水平显著降低。然而，只有当FSBM替代水平达到60%时，才观察到occludin、zo-1和tricellulin基因表达水平显著降低，muc-2基因表达水平显著升高。此外，SBM替代水平达到并超过45%时，后肠促炎细胞因子tnf-α和il-1β表达水平显著升高，抑炎细胞因子tgf-β1表达水平显著降低。FSBM替代水平达到60%时，上述促炎细胞因子表达水平显著升高。与鱼粉组相比，FSBM组大菱鲆抑炎细胞因子tgf-β1表达水平无显著差异。 本研究选取FM、SBM45及FSBM45组大菱鲆进行肠道菌群分析。结果表明，大菱鲆肠道优势菌为Proteobacteria、Firmicutes和Bacteroidetes，摄食SBM及FSBM均显著改变了肠道菌群丰度及多样性。PCoA分析表明大菱鲆肠道菌群表现出显著的食物聚类，大菱鲆肠道菌群结构受到摄食饲料种类的显著影响。然而，相比于SBM45组，FSBM45与FM组大菱鲆的菌群结构更加相似。进一步分析表明，门水平上，与鱼粉组相比，摄食SBM显著减少了Firmicutes并增加了Bacteroidetes的相对丰度。属水平上，摄食SBM显著增加了Bacteroides、Prevotellaceae和Enterobacteriaceae的相对丰度，显著减少了Lactococcus和Lactobacillus的相对丰度。然而，摄食FSBM减缓了SBM诱导的大菱鲆菌群结构的变化。本研究表明，摄食FSBM能增强大菱鲆生长性能、饲料利用能力并通过增强肠道消化酶活性、压制炎症反应及减缓豆粕诱导的肠道菌群紊乱进而改善大菱鲆的肠道健康。 4，Shewanellasp.MR-7对LPS诱导的大菱鲆肠道功能障碍的修复机制 本研究通过测定肠道组织学、炎症反应、粘膜屏障功能和菌群结构评估了Shewanellasp.MR-7是否能减缓LPS诱导的大菱鲆肠道功能障碍。将初始体重70.00±2.00g的大菱鲆随机分为3组，以强饲空白面团的大菱鲆为对照，再设置两个实验组，一组大菱鲆强饲面团加LPS，另一组强饲面团加LPS和Shewanellasp.MR-7。每组24尾鱼，每尾鱼每天强饲1g相应的面团，连续强饲一周后取样分析，结果表明：Shewanellasp.MR-7显著减缓了LPS诱导的肠道损伤和炎症反应，表现为比LPS处理组更高的绒毛和微绒毛高度。研究表明Shewanellasp.MR-7压制了LPS诱导的TLR-NF-κB信号通路的激活，使细胞因子的基因表达维持在正常水平，从而减缓炎症反应。相比于LPS处理组，Shewanellasp.MR-7组大菱鲆后肠杯状细胞数量和muc-2基因表达量显著降低。另外，Shewanellasp.MR-7修复了LPS诱导的肠道紧密连接蛋白相关基因（zo-1、occludin、tricellulin和claudin-3）的下调。进一步研究表明，强饲Shewanellasp.MR-7一定程度上抵消了LPS诱导的大菱鲆肠道菌群结构的改变，增强了益生菌乳酸菌Lactobacillus并抑制了假单胞菌Pseudomonas的生长，从而维持了整体的菌群平衡。综上，本研究表明Shewanellasp.MR-7能有效的减缓LPS诱导的大菱鲆肠道炎症、粘膜屏障功能障碍及菌群紊乱。
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