摘要
如何快速和精准地检测致病菌一直是亟待解决的问题。适配体传感器具有灵敏度高、特异性强、耗时短等优点，在解决致病菌快速和精准检测的问题中极具潜力，因而得到了广泛的研究关注。本研究以铜绿假单胞菌和幽门螺旋杆菌两种致病菌为研究对象，通过高通量测序辅助的全细菌指数富集的配体系统进化技术（SELEX）筛选得到该两种菌的高特异性适配体（Aptamer），并研究针对该两种致病菌的新型适配体荧光生物传感器，以实现铜绿假单胞菌和幽门螺旋杆菌的快速灵敏检测。 首先，采用高通量测序辅助的全细菌SELEX技术筛选获得铜绿假单胞菌的高亲和力、高特异性适配体。高通量测序结果中包含1712478条ssDNA序列，分析得到具有最高序列丰度的5个适配体候选物，即Pa-A1（8874条），Pa-A2（6446条），Pa-A3（6056条），Pa-A4（2898条），Pa-A5（5521条）。通过解离常数值测定和特异性测定，得到亲和力高，特异性强的铜绿假单胞菌适配体，Kd值为14.11±2.59nM。高通量测序方法的使用解决了SELEX过程中由Sanger测序导致的候选适配体识别不准确的问题。 其次，制备了表面具有羧基的碳点（CDs），与5’端修饰氨基的Pa-A1适配体进行结合形成Aptamer-CDs缀合物，然后在体系中引入猝灭剂氧化石墨烯（GO），通过荧光共振能量转移将Aptamer-CDs的荧光猝灭。当体系中存在铜绿假单胞菌时，Aptamer-CDs可与铜绿假单胞菌特异性结合，复合物从GO表面脱离，荧光恢复。根据Aptamer-CDs的荧光恢复程度与铜绿假单胞菌浓度之间的线性关系实现对样品中铜绿假单胞菌的定量检测，线性检测范围为101-108CFU/mL，检测限为9CFU/mL。该方法已成功应用于模拟实际水样中铜绿假单胞菌的检测,检测结果与平板计数法的检测结果无显著差异。为铜绿假单胞菌的检测提供了一种快速、灵敏度高、特异性强的新方法。 进一步，高通量测序辅助的全细菌SELEX技术筛选得到幽门螺旋杆菌的高亲和力、高特异性适配体Hp-1，其Kd值为36.91±11.1nM。针对氧化石墨烯对碳点猝灭效率低导致的背景荧光值高的问题，使用Fe3+作为碳点的猝灭剂，构建了铁载体螯合Fe3+促动的CDs荧光恢复的适配体传感器。适配体Hp-1与Fe3O4超顺磁纳米颗粒（SPMNPs）共价结合形成SPMNPs-Hp-1作为捕获模块，实现幽门螺旋杆菌的捕获与富集。随后，血红素（Heme）与甲磺酸去铁胺（DFO）通过PEG连接形成Heme-PEG-DFO缀合物作为促动模块，该缀合物能够通过血红素与捕获的幽门螺旋杆菌结合，形成SPMNPs-Hp-1-H.pylori-Heme-PEG-DFO复合物。该复合物通过DFO螯合信号模块Fe3+/CDs溶液中的Fe3+使碳点的荧光得到恢复。验证了利用铁载体螯合Fe3+原理制备铁载体螯合Fe3+促动的CDs荧光恢复的适配体传感器的可行性。 最后，对构建的铁载体螯合Fe3+促动的CDs荧光恢复的适配体传感器进行条件优化，确定最佳检测时间为45min。该传感器对幽门螺旋杆菌具有良好的线性响应，在10至104.8CFU/mL时，荧光恢复率与幽门螺旋杆菌的浓度之间呈线性关系，校正曲线由（F-F0）/F0=0.112x-0.0162，检测限（LOD）为3CFU/mL；在幽门螺旋杆菌浓度为104.8至108CFU/mL时，荧光恢复率与幽门螺旋杆菌的浓度之间呈另外一种线性关系，校正曲线为（F-F0）/F0=0.0152x+0.4654。该传感器可应用于儿童粪便模拟样品的检测，在菌浓度为1000CFU/mL和100CFU/mL时回收率达到93%和87%，为儿童幽门螺旋杆菌感染的检测提供了灵敏高效且具有应用前景的非侵入型方法和工具。
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