摘要
大菱鲆又称“多宝鱼”，属于鲽形目鲆科，是我国北方海域重要的经济养殖鱼类。近年来，随着大菱鲆养殖规模的不断扩大，鱼类疾病种类和范围也在不断扩大，主要包括细菌性疾病和病毒性疾病，所以对大菱鲆免疫系统的研究尤为重要。免疫系统由天然免疫系统和获得性免疫系统组成，其中天然免疫是机体抵抗外源入侵的第一道防线。天然免疫经由模式识别受体（patternrecognitionreceptors,PRRs）识别抗原相关分子模式（pathogenassociatedmolecularpattern,PAMPs）完成对外源物质的识别工作。Toll样受体（Tolllikereceptor,TLR）是一种存在于无脊椎动物和脊椎动物中单一的、非催化的、膜生的PRR，可以识别多种PAMPs。现已发现20多种TLR，其中TLR2属于TLR1家族能够特异性识别细菌的脂磷璧酸（Lipoteichoicacid,TLA）、肽聚糖（peptidoglycan,PGN）和真菌的酵母聚糖（zymosan）。机体受到上述刺激物刺激后会启动免疫信号通路，但目前关于大菱鲆TLR2（smtlr2）的研究较少。 本文采用同源PCR克隆策略，具体包括逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）、cDNA末端快速扩增（SMARTRACE）和染色体步移（GenomeWalking）等方法，从健康大菱鲆的脾中克隆出Smtlr2的全长cDNA和全长基因序列，研究了smtlr2基因在组织特异性表达以及经过LPS、PGN和多聚肌苷酸：胞苷酸（Polyinosinic:polycytidylicacid，poly(I:C)）刺激后的表达模式，对tlr2在大菱鲆免疫系统中的功能做了初步的分析。 根据GenBank数据库中TLR2的序列保守区域设计简并引物，采用RT-PCR法获得到核心片段，再通过3''RACE获得3''端序列，利用GenomeWalking技术获得5''端序列；以基因组序列为模板，采用常规PCR法，分段扩增，获得内含子序列；将所获得的cDNA片段和基因片段拼接和比对后，最终确定smtlr2全长cDNA序列和基因序列。smtlr2cDNA全长为3190bp，包含一个长度为2451bp的开放阅读框（openreadingframe,ORF），编码一个包含816个氨基酸的序列。其5''非翻译区（5''terminaluntranslatedregion,5''UTR）长为771bp，3''非翻译区（3''terminaluntranslatedregion,3''UTR）长为702bp。所推导的Smtlr2蛋白与其他物种TLR2一样具有典型的TLR结构，包含一个胞外的LRR结构域，一个胞内的TIR结构以及一个连接二者的跨膜结构域。Smtlr2氨基酸序列与其他鱼类的TLR2氨基酸序列具有很高的同源性（45.3%-76.1%），其中与牙鲆的同源性最高达76.1%。smtlr2基因全长为9093bp，包含12个外显子和11个内含子。 本论文还采用了荧光定量PCR（q-PCR）技术，对大菱鲆体内的12个组织（脑、鳃、胃、肠、心脏、头肾、体肾、肝、脾、性腺、肌肉、皮肤）中smtlr2mRNA的表达情况进行分析发现smtlr2mRNA在所有检测的组织中都有表达，其中在头肾、体肾和脾这些免疫器官以及肝脏这一消化器官中具有高水平表达量；在肠、鳃和心脏中具有中等水平表达量，在脑、胃、性腺、肌肉和皮肤中具有低水平表达量。 为进一步了解smtlr2对PAMPs的免疫应答模式，本论文采用肽聚糖作为革兰氏阳性菌的代表刺激物，脂多糖作为革兰氏阴性菌的代表系刺激物以及多聚肌苷酸：胞苷酸（Polyinosinic:polycytidylicacid，poly(I:C)）作为病毒的代表刺激物对大菱鲆进行免疫刺激实验，然后对大菱鲆的免疫组织（鳃、头肾和脾）和非免疫组织（皮肤）中smtlr2mRNA的表达变化进行了分析。我们发现在接受这三种刺激后，所有免疫组织中smtlr2mRNA的表达水平都出现了明显的上调，而在非免疫组织中无明显变化。这一结果表明Smtlr2在鱼类抗细菌和病毒免疫过程中起到了非常重要的作用 本文的研究结果为深入了解大菱鲆Toll样受体的信号传导机制，开展大菱鲆病害防控工作提供了重要的理论基础。
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