摘要
大菱鲆肉质鲜嫩、营养丰富，是我国重要的海水养殖鱼类之一。大菱鲆高蛋白和高水分的特点，在贮藏运输过藏中极易滋生微生物而引起腐败变质。群体感应（QuorumSensing，QS）作为细菌之间相互交流的一种机制已被证明参与了食品腐败进程。目前已在多种食品（果蔬、牛奶、猪肉等）中检测出QS自诱导物，这些自诱导物通过调控腐败微生物的生长代谢而影响食品的腐败进程。 本文以QS为切入点，探究真空包装大菱鲆在冷藏过程中的菌相变化及其相关的QS现象，为进一步明确水产品冷藏过程中腐败微生物的致腐机制提供理论依据，为开发基于干扰QS系统为靶点的食品保鲜剂提供实验基础。主要研究内容及结果如下： 1.真空包装冷藏大菱鲆贮藏过程中的品质变化 根据质量指标法（QIM）对冷藏大菱鲆进行了感官评价，结果表明：黑色体表和粘液是影响感官品质的主要因素，真空包装冷藏大菱鲆的货架期为16d。以挥发性盐基氮（TVB-N）、pH值、挥发性有机成分（VOCs）和微生物变化为指标，分别评价了大菱鲆冷藏过程中鱼皮和鱼肉的品质变化，结果显示：鱼皮和鱼肉中TVB-N含量和pH值增长缓慢且差异不大；鱼皮和鱼肉中都含有丰富的醛类和烷烃类挥发性有机成分，苯甲醛和2,4-庚二烯醛是赋予鱼肉独特香味的呈味物质，醛类物质随大菱鲆鲜度的下降而减少；整个贮藏过程中鱼皮中的细菌总数、产硫菌、假单胞菌、乳酸菌和肠杆菌数量均显著高于鱼肉中的数量（Plt;0.05）；鱼皮和鱼肉的菌相在贮藏初期差异较大，贮藏末期时菌相趋于一致，均以希瓦氏菌和肉食杆菌为优势腐败菌，且希瓦氏菌是真空包装冷藏大菱鲆贮藏过程中的特定腐败菌。 2.真空包装大菱鲆冷藏过程中QS自诱导物的变化 利用报告菌株法检测真空包装大菱鲆冷藏过程中QS自诱导物的产生情况，在冷藏大菱鲆中检测到N-酰基高丝氨酸内酯类（AHLs，C6-HSL）和呋喃硼酸内酯类（AI-2）两类QS自诱导物，且随贮藏时间的延长，两类自诱导物的浓度均增加。进一步分析证明该腐败过程中的AHLs自诱导物主要由沙雷氏菌属（产3-oxo-C6-HSL）和气单胞菌属（产C4-HSL和C6-HSL）产生；AI-2自诱导物主要由希瓦氏菌属产生。体内实验结果表明，外源C4-HSL和C6-HSL缩短了微生物生长的延滞期和增加了微生物的最大生长速率，加速了冷藏大菱鲆中TVB-N的产生；而3-oxo-C6-HSL对冷藏大菱鲆的腐败进程没有显著影响；外源C4-HSL、C6-HSL和3-oxo-C6-HSL显著提高了希瓦氏菌属所占细菌总数的比例；4,5-二羟基-2,3-戊二酮（DPD）延长了细菌生长的延滞期。以上结果证明，AHLs和AI-2通过调控微生物的生长动力学参数参与了真空包装冷藏大菱鲆的腐败进程。 3.蛋白质组学水平评价AHLs对希瓦氏菌生长代谢的影响 从ShewanellaZ4基因组中扩增出AHLs的受体基因luxR；外源添加AHLs与希瓦氏菌ShewanellaZ4共培养实验证明，ShewanellaZ4可以利用AHLs作为QS自诱导物。利用蛋白质组学技术评价C4-HSL、C6-HSL和3-oxo-C6-HSL对ShewanellaZ4蛋白表达的影响，共有355个差异表达的蛋白，其中224个蛋白点表达下调，131个蛋白点表达上调。对差异表达倍数较高的蛋白点进行质谱分析，共有23个蛋白质被成功鉴定，包括柠檬酸合酶、甘油激酶、多糖脱乙酰酶、β-丙氨酸转氨酶等与生长调节相关的蛋白，腺苷酸琥珀酸合成酶、次黄嘌呤-5''-磷酸脱氢酶和DNA连接酶等与遗传代谢相关的蛋白，延胡索酸还原酶、琥珀酸半醛脱氢酶、压力反应蛋白等与环境适应相关的蛋白。且以添加C6-HSL和3-oxo-C6-HSL的反应更为明显。 4.希瓦氏菌利用沙雷氏菌的AHLs对两株菌生长代谢的影响 以大菱鲆冷藏过程中的两种腐败菌—利用AHLs的希瓦氏菌ShewanelaZ4和产AHLs的沙雷氏菌SerratiaA2为对象，探究其在体外条件下的相互关系，结果显示，在对数期ShewanelaZ4能够利用SerratiaA2产生的AHLs自诱导物调控自身生长，但在稳定末期SerratiaA2产生的代谢产物抑制了ShewanelaZ4的生长。利用SerratiaA2上清培养ShewanelaZ4，出现类似的生长趋势。在营养相对贫瘠的AB培养基中，ShewanelaZ4可以利用AHLs促进自身生长，但在营养丰富的LB培养基中生长没有受到显著影响。SerratiaA2的蛋白酶产生和生物膜形成能力显著高于ShewanelaZ4（Plt;0.05），共培养过程中，蛋白酶活性和生物膜形成介于两者之间。以上结果表明ShewanelaZ4的行为性状可能受Serratiaamp;nbsp;A2分泌的AHLs影响。 5.评价QS抑制剂—溴化呋喃酮对冷藏大菱鲆货架期的影响 溴化呋喃酮(BMFC-30)能够有效干扰报告菌株紫色杆菌CV026和沙雷氏菌SerratiaA2的QS系统的正常表达。不影响生长浓度下的BMFC-30显著抑制紫色杆菌的紫色菌素产生，减少了沙雷氏菌AHLs的产生和蛋白酶的分泌，促进了沙雷氏菌生物膜的形成。将BMFC-30应用在真空包装大菱鲆冷藏过程中，BMFC-30可以显著延长大菱鲆的货架期，且随BMFC-30浓度的增加，保鲜效果越好。
NETL