摘要
本研究在中国北方高温期对长牡蛎（Crassostreagigas）和葡萄牙牡蛎（C.angulata）进行杂交育种研究，系统地探讨了两者杂交的子代生长情况及杂种优势情况，进而评估杂交育种的可行性，为长牡蛎和葡萄牙牡蛎的遗传改良和品种选育奠定了基础；从生理水平和转录水平比较研究长牡蛎和葡萄牙牡蛎自交及杂交D形幼虫的低温胁迫应答情况，探讨牡蛎幼虫抗低温应答机制。主要研究结果如下： 1、通过2×2完全双列杂交的方式对长牡蛎和葡萄牙牡蛎开展杂交育种，在海水盐度30、温度28℃情况下，长牡蛎卵径为48.84±0.27μm，显著小于葡萄牙牡蛎卵径50.52±0.23μm；葡萄牙牡蛎自交实验组(A♀×A♂,AA)、长牡蛎自交实验组(G♀×G♂,GG)和葡萄牙牡蛎♀×长牡蛎♂实验组(A♀×G♂,AG)、长牡蛎♀×葡萄牙牡蛎♂实验组(G♀×A♂,GA)杂交组受精率和孵化率均较高，达到92.10%和90.67%、96.03%和83.67%、96.90%和86.33%、92.21%和83.33%，各组间差异不显著；D形幼虫大小受母本影响严重，各组壳长AGgt;AAgt;GGgt;GA。 浮游幼虫期间，AA组生长速度最快、成活率最高；AG组其次，其生长速度杂种优势在浮游幼虫初期显著、后期逐渐不显著，而存活率方面始终表现出杂种优势；GA组在生长速度方面没有体现出杂种优势，存活率方面体现出杂种劣势。虾池过渡阶段，各组稚贝生长较快；海上越冬阶段，幼贝生长缓慢。至180日龄，各组壳长相差不大。成活率方面各组差异不显著。 2、使用盐度20、25、30和35t的海水对AA、AG、GA、GG组牡蛎幼虫进行孵化和培育，结果发现：D形幼虫大小与孵化盐度强弱并无显著线性关系。四组幼虫在不同盐度的海水中进行培养时，AA组和AG组在盐度为25和20时、GA组和GG组在盐度为25和30时生长较快，眼点出现较早。各组幼虫在盐度30时成活率最高，在35时生长速度最慢、成活率最低。从眼点幼虫出现的时间判断各组生长速度关系，为AAgt;AGgt;GAgt;GG。 3、在幼虫壳长超过150μm时，分别以金藻、金藻+扁藻、金藻+小球藻+扁藻、金藻+角毛藻+扁藻、金藻+小球藻+角毛藻+扁藻的方式对4组幼虫进行投喂培养，结果发现：对于牡蛎壳顶幼虫AA组、AG组和GA组，金藻+小球藻+角毛藻+扁藻的混合饵料对幼虫生长的促进效果最好、出现眼点幼虫最快，而仅投喂金藻组效果最差。金藻中掺加扁藻对牡蛎壳顶幼虫生长促进效果较好，单独掺加小球藻或角毛藻对于幼虫生长的促进作用不显著，而同时加入则有明显的促进作用。 4、采用COI基因确定母本来源、CG44确定杂交子，两者相结合的手段来进行长牡蛎和葡萄牙牡蛎杂交子代的遗传鉴定，使用COI基因多重特异性PCR可以简单、快捷检测母本；根据CG44基因测序结果中是否有BsrGI酶切位点“TGTACA”可以明确地分析杂交子，BsrGI酶PCR-RFLP反应可以通过电泳结果直接判断出杂交子。 5、对长牡蛎与葡萄牙牡蛎杂交D形幼虫进行6~8℃低温胁迫，比较研究胁迫后生长、存活及非特异性免疫指标特征，结果发现：四组幼虫均随着持续低温胁迫时间的延长，生长速度减缓、存活率降低；低温胁迫后3天内为幼虫恢复期，生长极缓慢；杂交组GA在低温胁迫处理后存在明显的生长速度优势。 非特异性免疫指标方面，低温胁迫后，葡萄牙牡蛎自交子代AA组SOD活力较高，随着持续低温胁迫时间的延长，四组SOD活力均呈现先升高后降低的总体趋势；GG组和GA组T-AOC活力、MDA含量、GSH含量较高，而AA组和AG组活力/含量较低；在不胁迫或经过不同时间的低温胁迫时，AA组的AKP/ALP活力最高，其次是AG组，而GA和GG组最低。杂交子组AG组和GA组在非特异性免疫指标中未体现出显著的杂交优势，而是体现出明显的母本效应。 6、对长牡蛎和葡萄牙牡蛎自交和杂交幼虫分别进行低温胁迫，采用转录组测序技术分析各组基因转录表达情况，各组均获得500million左右的HighQualityCleanReads，各组已知基因数目在23511~24426之间，占参考基因组基因总数（28409个）的82.76~85.98%。经功能注释和表达差异分析，杂交组AG组显著上调的差异基因最多，为615个，AA组最少，仅为468个；在下调基因方面，GG组显著下调差异基因最多，达到了2647个，约为GA组的2.3倍。但是，GA组和GG组的显著上调差异基因数量相同，均为495个。经GO注释和KEGG富集，AA组、AG组、GA组和GA组分别得到483条、490条、421条、518条GOterms和139条、144条、123条、159条KEGG通路。研究中得到的低温胁迫下幼虫显著性差异表达基因主要与能量代谢、信号转导、免疫调节等生物学过程有关。低温胁迫后，各组幼虫差异表达基因富集到的通路并不完全一致，体现出品种差异性。筛选出一些牡蛎幼虫低温胁迫应答的关键基因，可作为候选基因进行牡蛎免疫亲代遗传研究。
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