摘要
胰岛移植是治疗Ⅰ型糖尿病（胰岛素依赖型糖尿病）较为理想的方式，但胰岛供体来源有限、分离纯化程序繁琐以及移植后的免疫排斥反应极大地限制了其临床应用。因此，寻找胰岛替代细胞移植治疗I型糖尿病成为目前研究的热点。脂肪间充质干细胞(MesenchymalStemCells，MSCs)不涉及伦理问题，容易分离和培养，具有较强的增殖和分化能力，移植后不仅具有免疫调节和免疫抑制能力，而且能够促进组织修复。通过模拟胰岛β-细胞发育环境，改变培养基成分可将脂肪MSCs体外诱导成胰岛素分泌细胞(Insulin-Producingcells，IPCs)，但诱导程序复杂、条件苛刻、易对细胞造成损伤，诱导成本大，需要多种不同浓度的细胞因子、小分子化合物和信号通路激活／抑制剂共同配合，且诱导分化效率不理想。因此，寻求更加简便、高效的方法体外获得高成熟度的IPCs是一个亟待解决的问题。 本研究基于经过筛选得到的最优诱导程序，将脂肪MSCs诱导分化为IPCs，采用绝对定量转录组测序分析，研究在此分化过程中相关基因和信号通路的表达变化情况，分析和筛选出在分化过程中可能起重要作用的调控基因，并对其进行了功能验证。以经过筛选的级联调控基因为基础，引入调控基因，组成多个多基因共表达组合，通过对其诱导分化效率的比较、分析和筛选，得到6基因高效调控基因组合，重编程脂肪MSCs为胰岛β-细胞，命名为：RM-pCs（ReprogrammingMSCs-derivedisletp-cells），对RM-pCs的免疫原性变化进行了检测。将RM-pCs和脂肪MSCs共同移植于模型糖尿病犬和临床糖尿病犬中，验证RM-pCs治疗犬糖尿病的可行性。试验结果如下： 1．脂肪MSCs诱导分化为IPCs最优方案的确定 成功分离得到了犬脂肪MSCs，并通过形态观察、生长曲线测定、三系分化和流式细胞术对细胞进行了鉴定。使用5个诱导方案将脂肪MSCs诱导分化为IPCs，系统地比较了这些方案的诱导分化效率，筛选出最优诱导方案。 2．最优方案的绝对定量转录组测序分析 对最优诱导方案的各个阶段细胞进行了绝对定量转录组测序分析，获得了脂肪MSCs诱导分化为IPCs的大量基因数据，共得到15561个差异表达基因(Differentiallyexpressedgenes，DEGs)。在GO功能和KEGG通路富集分析中，分别得到126和266个DEGs以及众多信号通路，其可能与脂肪MSCs诱导分化为IPCs以及胰岛素分泌有关。根据差异表达的显著性、各阶段的基因表达水平、基因的功能和蛋白互作分析结果，筛选得到了18个基因。 3．调控基因的筛选和功能验证 18个基因经过验证和筛选，发现5个基因（Dll1，Hnf1b，Foxa1、Pbx1和Rfx3）可刺激胰岛β-细胞发育调控相关基因的高表达。经过进一步的功能验证，发现分别过表达这5个基因可提高脂肪MSCs诱导分化为IPCs的效率和IPCs的胰岛素分泌量，分别沉默各个基因后，诱导分化效率和胰岛素分泌量降低，这5个基因可作为脂肪MSCs诱导分化为IPCs的调控基因。同时，对22个胰岛β-细胞发育级联调控相关基因进行了验证，筛选出了对脂肪MSCs向IPCs诱导分化影响最大的4个级联调控基因(Pdx1,Ngn3,Pax4和MafA)。 4．高效调控基因组合的确定 以4个级联调控基因Pdx1，Ngn3，Pax4和MafA为基础，分别引入5个基因Hnf1B，Dll1，Pbx1，Rfx3和Foxa1，组成多个多基因共表达组合。通过对各组合诱导分化效率的比较、分析和筛选，确定了6个基因(Pbx1，Rfx3，Pdx1，Ngn3，Pax4和MafA)组成的基因组合能够高效率地将脂肪MSCs重编程为RM-βCs，脂肪MSCs成团率为37.57%～44.40%，RM-βCs的胰岛素分泌量可达到犬成熟胰岛β-细胞的二分之一以上，此6基因组合可作为高效调控基因组合。 5．RM-βCs的免疫原性变化检测 采用6基因高效调控组合重编程脂肪MSCs为RM-βCs，对RM-βCs的免疫原性进行检测。体外检测结果表明，RM-βCs表面缺乏DLAClassⅡ分子和共刺激分子CD40、CD80，可抑制外周血单核细胞的增殖，无抗谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)和抗胰岛细胞抗体(ICA)的结合位点；预致敏后的脾细胞可引起RM-βCs凋亡。体内检测结果表明，移植RM-βCs到腹腔后可引起炎性细胞浸润等免疫反应。RM-βCs体外保持低免疫原性，移植于体内后免疫原性增强，RM-βCs免疫原性高于脂肪MSCs。 6．RM-βCs和脂肪MSCs共移植治疗模型糖尿病犬 通过85%胰腺切除和5mg/kg链脲佐菌素溶液配合，成功制备了犬Ⅰ型糖尿病模型。对模型糖尿病犬进行了细胞移植治疗，结果表明，移植的RM-βCs能够定植于犬体内，对高血糖刺激做出反应，在一定时间段内逆转机体的高血糖；移植RM-βCs后不会引起犬GADA和ICA水平的增高；RM-βCs与脂肪MSCs的共移植，能够使RM-βCs更好得发挥作用，延长RM-βCs发挥作用的时间。移植物检测结果表明，移植于体内的RM-βCs可分泌胰岛素，脂肪MSCs不分泌胰岛素，移植的细胞在后期可引起免疫细胞浸润。RM-βCs和脂肪MSCs共移植治疗模型糖尿病犬是可行的。 7．RM-βCs和脂肪MSCs共移植治疗临床糖尿病犬 将RM-βCs与脂肪MSCs共移植于2只临床Ⅰ型糖尿病犬中，观察治疗效果。结果表明，RM-βCs能够分泌胰岛素，在一定时间段内降低血糖；2只犬的外源胰岛素用量可分别降低75.00%和85.71%。移植RM-βCs后不会引起犬GADA和ICA和水平的上升。RM-βCs和脂肪MSCs共移植治疗临床糖尿病犬是有效的。 综上所述，6基因组合（Pbx1-Pdx1-Ngn3-Pax4-Rfx3-MafA）可高效率地将脂肪MSCs重编程为RM-βCs。RM-βCs体外保持低免疫原性，移植于体内后免疫原性增强。RM-βCs与脂肪MSCs共移植治疗犬糖尿病是可行的。本研究为胰岛替代细胞移植治疗Ⅰ型糖尿病提供了一个很好的参考和基础。
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