摘要
小麦条锈病严重威胁着全球小麦生产。其病原菌条形柄锈菌小麦专化型（Pucciniastriiformisf.sp.tritici，Pst）依赖其侵染结构“吸器”分泌效应子抑制植物防卫反应并建立寄生关系。因此，鉴定条锈菌致病过程中的关键效应子、探究效应子的功能，对开发持久抗病种质资源有着重要意义。课题组前期鉴定到两个多糖去乙酰化酶基因Pst_13661和Pst_13662，二者相似度为80%，发现Pst_13661通过发挥几丁质去乙酰化酶作用影响病菌致病性，但Pst_13662不具有酶活性。那么Pst_13662是否以及如何影响条锈菌的致病性？本论文围绕条锈菌效应子Pst_13662在条锈菌致病性中的功能及分子作用机制展开研究，主要结果如下： 1.Pst_13662对条锈菌致病性的功能分析 SignalP预测Pst_13662N端1-24位氨基酸为信号肽，利用酵母分泌系统验证其具有分泌功能，表明Pst_13662编码分泌蛋白；利用农杆菌侵染本氏烟瞬时表达Pst_13662能够抑制由促细胞凋亡蛋白Bax（BCL2-associatedX）诱导的细胞坏死。在烟草细胞中瞬时表达Pst_13662:GFP，发现Pst_13662定位于植物细胞质及线粒体。 为进一步解析Pst_13662在小麦条锈菌致病性中的功能，利用RNAi技术靶向沉默Pst_13662，创制了稳定的小麦转基因材料。对T2代Pst_13662-RNAi植株接种条锈菌毒性生理小种CYR32进行抗病性鉴定，发现野生型植株高度感病，而Pst_13662-RNAi植株抗性增强。组织学观察表明，条锈菌侵染24hpi和48hpi，Pst_13662RNAi#L6与L7植株中条锈菌菌丝变短，侵染面积减小，且120hpi条锈菌生物量显著降低，表明沉默Pst_13662削弱了条锈菌的致病能力，增强了植株对条锈菌的抗性。 2.Pst_13662互作靶标的筛选及验证 为解析Pst_13662促进条锈菌致病性的分子作用机制，利用酵母双杂交（YeastTwo-hybrid,Y2H）技术在小麦与条锈菌亲和互作的cDNA文库中筛选其在植物细胞内的互作靶标，共获得59个候选互作蛋白，Y2H发现小麦苯丙氨酸解氨酶TaPAL能够与Pst_13662互作。利用农杆菌介导的瞬时表达技术在本氏烟中表达TaPAL:GFP，显示TaPAL定位于植物细胞质及叶绿体，为与Pst_13662互作提供了空间依据。进一步利用双分子荧光互补（BimolecularFluorescenceComplementation,BiFC）和免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）技术明确了Pst_13662与TaPAL相互作用。 3.Pst_13662与TaPAL互作的分子机理初探 TaPAL是水杨酸（salicylicacid,SA）合成的关键酶，在小麦抗病反应中发挥重要作用。瞬时过表达TaPAL的烟草叶片中，较对照组叶片SA含量显著增加；共表达Pst_13662和TaPAL后，SA含量下降，说明Pst_13662与TaPAL作用能够抑制SA的合成。进一步研究发现，共表达Pst_13662和TaPAL时，Pst_13662影响TaPAL蛋白量的积累。加入蛋白酶抑制剂MG132后，减弱了TaPAL蛋白量降低的趋势。综上，26S泛素-蛋白酶体介导TaPAL降解，推测Pst_13662可能通过与TaPAL互作促进其降解，抑制SA合成，从而参与抑制小麦抗性反应。
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