摘要
在育龄妇女中，严重的卵巢损伤通常会伴有卵巢早衰(POF)，主要症状为闭经时间≥4～6个月，两次间隔4周以上，FSH＞40U/L。卵巢早衰常伴随虚热盗汗、骨质疏松、不孕等症状，导致患者生活质量显著降低。目前针对卵巢早衰目前最常用的治疗方法为激素替代疗法(HRT)，但其仅改善雌激素缺乏所致症状，无法从根本上改善卵巢结构和功能，且长期使用有子宫内膜癌、卵巢癌增加的风险。因此我们亟需更安全有效的治疗方式。 目的:1、提取与培养脐带间充质干细胞，并鉴定其符合干细胞的特性。2、构建卵巢早衰模型小鼠，并鉴定模型构建成功。3、合成载有人脐带间充质干细胞(MSC)的基质胶复合支架，探索其是否可以修复POF小鼠的卵巢功能与卵巢结构。 方法:1、使用组织块贴壁法培养脐带间充质干细胞，通过流式鉴定CD34、CD45、CD90、CD105及成骨、成脂定向诱导分化实验来鉴定间充质干细胞的鉴定。2、通过流式及RT-PCR技术对体外培养的MSC与MSC/Matrigel进行检测，以判断Matrigel是否导致干细胞特性及细胞因子表达量发生变化。3、通过连续15天向小鼠注射环磷酰胺建立POF模型。通过卵巢石蜡切片的HE染色、Masson染色等方法来判断小鼠卵巢结构与功能的改变，从而鉴定卵巢早衰小鼠模型构建成功。4、将MSC/Matrigel复合支架通过手术直视下原位注射的方法移植到卵巢POF小鼠卵巢内。五天后取小鼠卵巢做冰冻切片以观察卵巢内MSCs分布，以及Matrigel对MSCs体内存活的影响。5、五周后，处死各组小鼠，取出卵巢，脱水包埋成石蜡切片。通过对卵巢石蜡切片进行HE染色来观察卵巢结构和卵泡的形态;通过卵泡计数来观察各级卵泡数量的变化:通过对卵巢石蜡切片进行Masson染色来观察卵巢组织组织纤维化的程度;通过对卵巢石蜡切片进行α-SMA、CD31免疫荧光来检测卵巢内血管数量;通过Westem技术测定小鼠卵巢蛋白中VEGF-A的表达;通过对小鼠卵巢石蜡切片进行Ki67免疫荧光来评估颗粒细胞的增殖水平。 结果:1、组织块贴壁7天左右可见到部分脐带间充质干细胞爬出，10天左右可进行传代。细胞呈梭形、簇状生长，经鉴定高表达CD90、CD105，低表达CD34、CD45表面标志物，具有成骨、成脂定向诱导分化的潜能，表明其具有干细胞特性。2、对体外培养的MSC与MSC/Matrigel进行检测，结果显示与Matrigel体外共培养并未改变MSC的干细胞特性，但相比于MSC组，MSC/Matrigel组细胞中EGF、TGF-β3表达水平升高;TGF-β1表达水平降低。3、对小鼠腹腔注射环磷酰胺15天后，POF组小鼠可见卵巢表面积减小，闭锁卵泡增加，卵巢皮质纤维化程度升高，动情周期延长/紊乱比例增加，表明环磷酰胺腹腔注射使小鼠卵巢结构受到了一定程度的破坏，POF模型建立成功。4、体内示踪实验证明在卵巢原位注射5天时，Matrigel可以促进MSC卵巢内存活的数量，促进MSC增殖比例，减少MSC凋亡。5、对POF小鼠进行MSC/Matrigel复合支架原位移植5周后，相比于POF组，MSC/Matrigel组各级卵泡数量明显增加，卵巢皮质纤维化水平显著降低，卵巢中血管数量显著增加，卵巢蛋白中VEGF-A水平显著上调、卵泡中颗粒细胞的增殖水平显著提高，表明MSC/Matrigel原位注射使POF小鼠卵巢卵泡数量及卵巢结构得到了部分恢复。 结论:我们成功培养了具备干细胞特性的脐带间充质干细胞，成功构建了卵巢早衰模型，并通过体内外实验证明了MSC/Matrigel卵巢内原位注射可以在部分程度上促进POF小鼠中卵泡数量与卵巢结构的修复。
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