摘要
磷是植物生长发育必需大量元素之一。虽然土壤中磷含量充足，但可供植物利用的无机游离态磷非常少，因此植物进化出复杂的机制来适应这种土壤缺磷的状态。拟南芥中一些与低磷胁迫相关的基因，如磷转运体、磷酸酶、转录因子已经被鉴定，但作为重要经济作物之一的油菜，其低磷应答基因仍鲜有研究。本研究从甘蓝型油菜(Brassicanapus)克隆鉴定了一个WRKY转录因子家族基因BnWRKY75，对其功能研究结果如下: 1.BnWRKY75的分离鉴定及序列分析 通过低磷应答基因筛选鉴定分析，从甘蓝型油菜中分离克隆了一个WRKY家族成员基因，其开放阅读框为444bp，编码147个氨基酸。通过序列分析发现该基因编码蛋白质与拟南芥AtWRKY75蛋白序列相似度达87％，系统进化分析也显示二者的同源性较高，处于进化树的同一个分支上，因此将其命名为BnWRKY75。 2.BnWRKY75的转录活性检测 WRKY家族是一类转录因子，为验证BnWRKY75是转录激活因子或是转录抑制因子，在酵母细胞中检测BnWRKY75是否具有自激活活性。通过转化酵母的缺陷培养基检测及X.鲥显色反应，均证明BnWRKY75是激活子。 3.BnWRKY75表达模式分析 分析了BnWRKY75在油菜根、茎、叶、花中的表达模式，结果显示其在根部表达量较高。克隆了BnWRKY75启动子序列，与GUS报告基因融合，转化拟南芥，获得拟南芥转基因植株。GUS活性分析发现，BnWRKY75启动子在转基因拟南芥幼苗发育早期没有活性，从幼苗发育第4天开始GUS信号在幼苗根中出现，GUS活性分析表明BnWRKY75启动子主要在根的成熟区和伸长区表达，成苗在叶基部和着生角果的基部表达。 4.BnWRKY75过量表达转基因拟南芥分析 构建过量表达载体转化拟南芥，通过表达分析鉴定转基因拟南芥中BnWRKY75表达量较高的株系。以过量表达BnWRKY75转基因拟南芥为材料进行低磷表型分析，结果显示，相比野生型，拟南芥过量表达转基因拟南芥地上部分花青素含量降低，转基因拟南芥体内无机磷含量显著提高，说明BnWRKY75过量表达促进了转基因拟南芥对无机磷的吸收和利用。更进一步检测低磷响应基因，结果显示过量表达中部分低磷应答基因表达上调，尤其是高亲和性磷转运蛋白基因AtPT2和AtPT1的表达显著提高，这些基因的上调可能是转基因拟南芥中磷含量提高的主要原因。 5.BnWRKY75油菜中过量表达分析 同时将BnWRKY75过量表达载体转化油菜，获得BnWRKY75过量表达转基因油菜植株(T0和T1代)。对T1代转基因油菜株系中BnWRKY75的表达量进行了检测，发现转基因株系L15表达量最高。但过量表达转基因株系叶中低磷相关基因表达量几乎没有变化，而衰老基因SAG12和SAG101显著上调。进一步的实验分析正在进行中。
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