摘要
一般性调控阻遏蛋白激酶2(GCN2，generalcontrolnonderepressible2kinase)是一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是真核起始因子2α(eIF2α)激酶之一。由于GCN2可以被不带电荷的tRNA激活，因此可以通过调节氨基酸的可利用性控制mRNA的翻译起始效率，使细胞有效的适应营养饥饿。这种调节系统对于营养缺失以及其他压力耐受非常重要。 利用WT和Gcn2基因敲除小鼠构建伤口愈合模型，发现Gcn2基因缺失后，小鼠皮肤伤口愈合的速度减慢。通过对伤口处病理切片观察发现，Gcn2基因缺失会导致伤口处免疫细胞浸润增加;免疫组化结果发现Gcn2基因缺失小鼠CD31和α-SMA染色减少，说明血管再生以及组织修复能力下降。随后检测了WT和Gcn2基因敲除小鼠伤口处免疫细胞的变化，发现伤口处免疫细胞数目没有差异。由于巨噬细胞在伤口愈合过程中非常重要，包括早期通过促炎作用吞噬细胞碎片和入侵的微生物，以及晚期通过产生抗炎因子和生长因子促进组织重塑，胶原形成促进伤口愈合，我们推测可能是由于巨噬细胞类型发生变化导致影响伤口愈合速率。对伤口愈合三天，五天的皮肤进行检测，发现WT和Gcn2基因敲除小鼠CD86+以及CD206+巨噬细胞比例发生变化，基因缺失导致巨噬细胞CD86+比例增加，说明炎性增加，CD206+细胞比例降低，说明巨噬细胞抑炎功能减弱。通过Real-timePCR检测M1和M2相关基因表达情况发现Cx3cr1，Il-6等促炎基因表达水平增加，CD206，Il-10，Tgfβ，Vegfa等抑炎基因表达水平下降。 通过伤口愈合模型，我们推测Gcn2基因缺失对于伤口愈合的影响可能是通过影响了巨噬细胞的极化所致。利用小鼠腹腔巨噬细胞体外极化诱导发现LPS+IFNγ诱导下，Gcn2缺失会导致M1型巨噬细胞极化增强，TNFα+细胞比例增加，促炎细胞因子表达量增加，而在IL-4或IL-10诱导的情况下，M2型巨噬细胞极化减弱，相关抑炎细胞因子表达量减少。为了进一步确定GCN2是影响巨噬细胞极化的原因，利用GCN2蛋白抑制剂抑制WT小鼠巨噬细胞的GCN2表达，通过IL-4刺激后发现确实减弱了巨噬细胞M2型极化。 为了探究GCN2缺失是否会引起与巨噬细胞极化相关通路改变进而引起巨噬细胞极化改变，对WT和Gcn2基因缺失小鼠巨噬细胞进行体外诱导极化后进行RNA-seq测序分析，发现LPS+IFNγ刺激后，Gcn2基因缺失后会导致NF-κB信号通路上调以及这些通路相关炎性细胞因子表达量上调，IL-4或IL-10刺激后会导致JAK-STAT信号通路，HIF-1信号通路，代谢通路等以及相关抑炎细胞因子表达量显著下调。通过Westernblot检测发现在LPS+IFNγ刺激下，Gcn2基因敲除小鼠巨噬细胞NF-κB信号通路磷酸化增强，在IL-4刺激下，Gcn2基因敲除小鼠巨噬细胞STAT6信号通路磷酸化减弱。说明Gcn2缺失后通过增强NF-κB信号通路使巨噬细胞M1极化增强，导致伤口部位巨噬细胞炎性增强，同时通过STAT6信号通路使巨噬细胞M2极化减弱，导致伤口部位巨噬细胞抑炎作用减弱，修复能力下降，最终影响了皮肤伤口愈合速度。这些结果对Gcn2基因功能研究提供了新思路，可能会对疾病情况下导致的伤口愈合问题提供一个治疗思路。
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