摘要
捻转血矛线虫（Haemonchuscontortus）是寄生于反刍动物胃肠道的优势线虫之一，宿主范围广泛，可以寄生于绵羊、山羊、牛、骆驼等反刍动物，在一些感染严重的地区，捻转血矛线虫的感染率可高达100%，其主要以反刍动物皱胃的毛细血管中的血液为食，严重时会导致宿主死亡。捻转血矛线虫在全球广泛存在，由于其致病性和繁殖力强的特点，在多个地区都造成了大范围的流行，这给全球羊养殖业都带来了巨大的经济财产损失。因此，准确诊断羊捻转血矛线虫病对于该病有效防治以及保障羊的健康养殖具有重要意义。本研究拟采用PCR技术，对陕西地区捻转血矛线虫分离株的内部转录间隔区（internaltranscribedspacer，ITS）基因序列进行扩增、测序和分析，以了解ITS基因的遗传变异情况；根据捻转血矛线虫ITS2基因特点，设计特异性引物并对退火温度进行优化建立粪便虫卵PCR检测方法，将所建立PCR应用于临床奶山羊粪便样品中捻转血矛线虫卵的检测，并与粪便镜检结果进行对比，获得以下结果： 1.对采自陕西咸阳地区不同年份的44株捻转血矛线虫分离株，进行ITS基因位点的扩增、测序和分析。结果显示，捻转血矛线虫ITS1的长度为400或404bp、种内变异率为0.0～3.6%，共27个类型，将其与参考序列比对发现存在16个碱基突变位点，ITS2的长度为231bp，种内变异率为0.0～6.9%，共20个基因类型，与参考序列比对发现共15个碱基突变位点。结果表明，陕西咸阳地区2015—2020年之间的羊捻转血矛线虫的ITSrDNA序列的种内变异率较小，且尚未出现种群的分化。种系发育进化树结果显示各国的分离株进化关系较近，且同一地区的不同分离株未汇聚在同一枝，初步分析表明，捻转血矛线虫的ITS基因的变异情况与不同的地理条件之间的相关性不明显，世界各地的捻转血矛线虫分离株之间存在较高的基因相似度。 2.基于特异性引物对（Hc.F、Hc.R）建立的PCR检测方法的特异性良好，能将捻转血矛线虫卵同其他常见线虫卵（细颈线虫、似血矛线虫、兰式毛尾线虫、尖尾线虫、网尾线虫、夏伯特线虫、蛇形毛圆线虫、粗纹食道口线虫、绵羊毛尾线虫等）特异性区分。PCR反应的最佳退火温度为53℃。在DNA模板含量较低（0.298pg）时，仍能检出，表明其具有较高的灵敏性。85份奶山羊粪便样品，经粪便镜检共检出23份捻转血矛线虫阳性粪样（27.06%，23/85），利用特异性PCR镜检共检出38份捻转血矛线虫阳性粪样（44.71%，38/85），且镜检和PCR方法诊断结果一致性一般（Kappa=0.530）。 综上所述，陕西咸阳地区的羊捻转血矛线虫的ITSrDNA基因序列的遗传进化程度较低。所建立的分子生物学方法能准确地将捻转血矛线虫卵从粪便样品中检测出，为临床检测捻转血矛线虫病提供了一种诊断方法。
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