摘要
目的：1）通过流式检测宫颈鳞癌患者外周血中经HPV16E6和E7抗原肽刺激的特异性T细胞免疫反应，比较CD4+T细胞亚群和CD8+T细胞亚群分泌IFN-γ、IL-2、TNF-α和IL-13这4种胞内细胞因子的表达模式，评估患者的T细胞功能状态。2）分析宫颈鳞癌患者外周血和癌组织中T细胞上PD-1的表达，同时结合患者肿瘤组织PD-L1的表达状态，阐明PD-1/PD-L1与临床特征和预后的相关性。3）结合前两部分，应用二代测序技术分析是否产生特异性免疫应答和不同PD-L1状态分组中的突变差异基因。对患者TMB水平与突变类型和临床特征相关性进行分析，并对可能免疫耐药的患者进行新抗原预测，为宫颈鳞癌患者预测免疫治疗获益和个体化或免疫联合治疗提供理论依据。方法：1）入组2017年9月至2020年11月在新疆医科大学第三临床医学院就诊的初治宫颈癌患者87例，提取患者治疗前外周血并分离PBMCs，分别进行HPV16E6和E7抗原肽诱导的体外培养胞内细胞因子染色实验，并收集患者临床病理特征。2）入组2017年9月至2019年10月在新疆医科大学第三临床医学院就诊的初治中晚期宫颈癌患者95例，提取患者治疗前外周血并采集患者宫颈癌组织，同时分离外周血中PBMCs和组织中的TILs。后期整理和制备入组患者病理石蜡切片备用。采用流式细胞技术检测外周血和癌组织中CD4+、CD8+T细胞上PD-1表达，免疫组化染色检测癌组织PD-L1表达，并结合患者随访进行预后分析。3）选取前期入组的45例患者进行NGS测序，根据前两部分结果进型亚组分析，探讨突变差异基因与TMB和临床特征的相关性。结果：1）宫颈鳞癌患者E6抗原肽刺激组CD4+T细胞产生的IFN-γ、IL-2和TNF-α的表达量均高于未刺激组，CD8+T细胞产生的IL-2和IL-13的表达量均高于未刺激组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。E7抗原肽刺激组CD4+T细胞产生的IL-2和TNF-α的表达量均高于未刺激组，CD8+T细胞产生的IL-2和IL-13的表达量均高于未刺激组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。在CD4+T细胞特异性免疫反应阳性组，超过半数患者存在多重细胞因子分泌情况且双重细胞因子共表达频率优于免疫反应阴性组。同时，iMFI分析显示共表达细胞因子种类越多，特异性免疫反应的强度越高。另外，HPV16E6特异性免疫反应与肿瘤大小和盆腔淋巴结有关，差异具有统计学意义（P＜0.05）。2）95例宫颈鳞癌患者癌组织中CD4+、CD8+T细胞PD-1表达量高于外周血，差异均有统计学意义（P＜0.05）。结合临床特征发现，癌组织中CD4+PD-1+表达与患者肿瘤直径相关，PD-L1表达与患者分期有关，差异均有统计学意义（P＜0.05）。另外，PD-L1阳性组中TILsCD4+PD-1+和CD8+PD-1+表达高于PD-L1阴性组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。生存分析结果显示PD-L1表达阳性的宫颈鳞癌患者预后较差，亚组分析发现TILs中CD8+PD-1+T细胞高表达组预后更差，差异均有统计学意义（P＜0.05）。COX回归分析结果显示，同步放化疗（HR=0.16195%CI为0.046-0.560，P=0.004）和PD-L1阳性（HR=3.36495%CI为1.180-9.589，P=0.023）是宫颈鳞癌患者预后的独立影响因素。3）应用NGS测序比较14例ICS实验阳性患者和12例阴性患者，体细胞SNV发现27%（7/26）的患者发生了FAT1基因的突变，阳性组和阴性组的突变发生率分别为42.86%（6/14）和8.33%（1/12），差异具有统计学意义（P=0.044）。CNV差异基因的表达均发生在特异性免疫反应阴性组。相比阳性组，基因MYC、DDR1和MDC1的CNV发生率分别为25%（3/12）、8.3%（1/12）和8.3%（1/12），差异均具有统计学意义（P＜0.05）。NGS测序比较22例PD-L1阳性患者和19例阴性患者，体细胞SNV发现44%（18/41）发生了PI3KCA基因的突变，22%（9/41）的患者发生了FAT1基因的突变，12%（5/41）的患者发生了KMT2D基因的突变，10%（4/41）的患者发生了DNMT3B基因的突变，差异均有统计学意义（P＜0.05）。CNV差异基因的表达均发生在PD-L1阳性组。相比阴性组，基因CD274、JAK2和PDCD1LG2的CNV发生率分别为13.6%（3/22）、9.1%（2/22）和9.1%（2/22），差异均有统计学意义（P＜0.05）。HPV阳性患者TMB值高于HPV阴性患者，差异具有统计学意义（P=0.032）。FAT1突变组TMB值高于未突变组，差异有统计学意义（P=0.018）。二代测序提示4例患者免疫治疗耐药基因突变，基于HLA和somaticSNV结果进行新抗原预测分析。HLA分型HLA-A*02：01和HLA-A*30：01对应了较多肿瘤新抗原。结论：1）87例宫颈鳞癌患者E6和E7刺激组较未刺激组的CD4+T细胞亚群更加反映Th1辅助细胞功能，并分泌更多IL-2、IFN-γ和TNF-α细胞因子。在CD4+T细胞特异性免疫反应阳性组，超过半数患者存在多重细胞因子分泌情况且双重细胞因子共表达频率优于免疫反应阴性组。同时，iMFI分析显示共表达细胞因子种类越多，特异性免疫反应的强度越高。另外，HPV16E6特异性免疫反应与肿瘤大小和盆腔淋巴结有关。2）95例宫颈鳞癌患者癌组织中CD4+、CD8+T细胞PD-1表达量高于外周血。结合临床特征发现，癌组织中CD4+PD-1+表达与患者肿瘤直径相关，PD-L1表达与患者分期有关。另外，PD-L1阳性组中TILsCD4+PD-1+和CD8+PD-1+表达高于PD-L1阴性组。生存分析结果显示PD-L1表达阳性的宫颈鳞癌患者预后较差，亚组分析发现TILs中CD8+PD-1+T细胞高表达组预后更差。COX回归分析结果显示，同步放化疗和PD-L1阳性是宫颈鳞癌患者预后的独立影响因素。3）HPV抗原特异性免疫反应阳性组和PD-L1阳性组存在突变差异基因FAT1，且FAT1突变组TMB值高于未突变组。另外，宫颈鳞癌患者TMB值与HPV状态有关，HPV阳性组TMB表达高于阴性组。免疫治疗耐药基因突变的4例患者患者HLA分型HLA-A*02：01和HLA-A*30：01对应了较多肿瘤新抗原。
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