摘要
日本沼虾（Macrobrachiumnipponense），又名河虾、青虾，广泛分布于我国和一些亚洲国家的部分淡水湖泊中。日本沼虾有分布广泛和适应性强等特性，在我国淡水经济生物养殖产业中占有重要地位，是我国最重要的淡水养殖品种之一。近年来，由于集约化养殖的发展，日本沼虾病害频发，而日本沼虾是无脊椎动物，缺乏特异性免疫，仅有先天免疫系统来抵抗病害，因此对日本沼虾先天免疫机制的研究十分重要。本课题研究了Bursicon、Relish和LGR2三种重要的可能与免疫相关的基因在日本沼虾体内的免疫功能，并得到以下结果： 1、Bursicon是一种与蜕皮相关的神经肽类激素，有研究发现它在无脊椎动物先天免疫中起到重要作用，本论文的研究集中在Bursicon基因在日本沼虾先天免疫中的作用。我们通过同源克隆分别得到日本沼虾体内的MnBurcison两个亚基（MnBursicon-α和MnBursicon-β）的全长序列。本研究对两个亚基分别进行讨论，MnBursicon-α序列全长959bp，其中开放阅读框为444bp，包含147个氨基酸；MnBursicon-β序列全长1370bp，其中开放阅读框为414bp，包含137个氨基酸。MnBursicon-α和MnBursicon-β分别编码MnBursicon-α蛋白和MnBursicon-β蛋白，蛋白结构域均包含1个信号肽和1个C端胱氨酸结结构域（CTCK）。MnBursicon-α主要表达在肝胰腺、血细胞和肠中，在心、胃和鳃中表达量较低，而MnBursicon-β主要表达在肝胰腺、胃和肠中，在鳃、心和血细胞中表达量较低。在金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌和白斑综合症病毒（WSSV）的感染下，虾的鳃和胃组织中MnBursicon-α和MnBursicon-β的表达量均呈现不同程度的上调。将基因MnBursicon-α和MnBursicon-β分别敲低，再分别检测抗菌肽的表达，发现6种抗菌肽表达被抑制（MnCru1、2、3和MnALF1、2和MnCar1）。同时，分别注射牛血清蛋白，Bursicon-α和Bursicon-β的重组蛋白，再次检测抗菌肽表达，发现与对照组相比，6种同样的抗菌肽（MnCru1、2、3和MnALF1、2和MnCar1）表达量升高。由此，我们认为Mnburcison通过调控抗菌肽的表达参与了日本沼虾的先天免疫过程。 2、Relish是IMD信号通路下游的转录因子，属于NF-κB蛋白家族，在入核调控抗菌肽表达中发挥重要作用。我们通过克隆得到MnRelish在日本沼虾体内的全长序列，通过研究发现MnRelish序列全长5082bp，其中开放性阅读框长3549bp，编码1182个氨基酸的肽链。蛋白包含1个N端的Rel同源结构域（RHD），1个IPT结构域，4个低密度结构域，6个锚蛋白重复和1个卷曲螺旋区域。MnRelish在鳃组织中表达量最高，其次是血细胞和肝胰腺，在心、胃和肠组织中表达量较低。在金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌和WSSV的感染下，虾的鳃和胃组织中MnRelish的表达量呈现不同程度的上调。将基因MnRelish敲低后，检测抗菌肽表达发现5种抗菌肽（MnCru1,MnCru2,MnCru6,MnALF1和MnALF2）表达下调。同时，敲低MnRelish基因后分别注射牛血清蛋白，Bursicon-α/β的重组蛋白。实验结果发现，敲低MnRelish基因后，与注射牛血清蛋白相比，注射Bursicon-α/β重组蛋白组有3种抗菌肽（MnCru1,MnALF1和MnALF3）表达明显下调。由此，我们认为MnRelish是调控抗菌肽表达的重要转录因子，参与了日本沼虾先天免疫的过程。 3、LGR是一种富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体，属于一种膜结合受体。我们在日本沼虾体内通过同源克隆得到一个LGR的的全长序列，通过生物学分析发现属于B型LGR，命名为MnLGR2。MnLGR2序列全长5921bp，其中开放性阅读框为4515bp，编码1504个氨基酸的肽链。蛋白含有1个七次跨膜结构域、12个富含亮氨酸的重复序列和5个低密度序列区域。MnLGR2在鳃组织中表达量最高，在胃、心、肠、肝胰腺和血细胞中表达量均不高。在金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌和WSSV的感染的虾中，MnLGR2表达量均呈现不同程度的变化。将该基因敲低后检测抗菌肽的表达，发现5种抗菌肽表达量升高（MnCru1,MnCru2,MnCru6,MnALF1和MnALF2），同时检测MnRelish的表达量，发现MnRelish的表达量在MnLGR2表达被抑制时反而升高。敲低基因MnLGR2后我们检测了proPO通路相关基因的表达量，发现4种proPO通路相关基因（MnPPAE1、2、3和MnPPAF）的表达量下调。同时，敲低基因MnLGR2后PO活性也明显下调。综上，我们推测MnLGR2通过抑制抗菌肽的表达来促进proPO通路相关基因的表达以及增加PO活性。
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