摘要
本文以我国重要海水养殖鱼类大黄鱼为研究对象，针对高脂与高植物油饲料导致的鱼体脂肪异常沉积与炎性反应等问题展开相关研究。研究内容主要包括大黄鱼法尼醇X受体（FXR)与小分子异源二聚体（SHP)的基因克隆，FXR的配体对其激活作用；饲料添加FXR天然配体鹅去氧胆酸对摄食高脂或高比例豆油饲料大黄鱼生长的影响；在上述摄食生长实验（在体实验）基础上，结合离体实验，研究FXR对大黄鱼肝脏脂肪代谢与炎性反应的影响及调控机制，探究以FXR作为靶点缓解大黄鱼脂肪异常沉积和炎性反应的可行性。本文主要研究内容和研究结果如下: 1.大黄鱼FXR和SHP的基因克隆及FXR的配体对FXR的激活作用 本实验对大黄鱼FXR和SHP基因进行克隆、序列分析和组织差异表达分析。实验克隆得到FXR基因全长2106bp，包含5’非编码区（UTR)153bp、3’UTR498bp和开放阅读框（ORF)1445bp，共编码484氨基酸。序列分析发现大黄鱼FXR编码蛋白具有核受体典型结构DNA结合域和配体结合域，并与鼠、人和其他鱼类相比具有较高保守性。通过构建大黄鱼FXR与绿色荧光蛋白（GFP)融合蛋白分析发现大黄鱼FXR具有核定位能力。组织差异表达结果显示，大黄鱼FXR在肝、肠和肾组织表达丰度较高，在肌肉、脂肪、眼、脑、脾和心脏中表达量较低。同时，本实验中，克隆得到SHP基因全长1228bp，包含5’UTR86bp、3’UTR368bp和ORF区774bp，编码258个氨基酸。序列分析发现大黄鱼SHP编码蛋白具有配体结合域而缺乏DNA结合域。组织差异表达结果显示，大黄鱼SHP在肝和肠中表达量最高，在心、脑、肌肉和脂肪中表达量较低。 为探究天然配体鹅去氧胆酸（CDCA)和合成激活剂GW4064对大黄鱼FXR的激活作用。首先通过双荧光素酶实验验证大黄鱼FXR对SHP的调控，结果表明过表达大黄鱼FXR促进SHP启动子活性，当共表达大黄鱼RXR时，FXR促进SHP启动子活性的作用被增强。同时结果表明，CDCA和GW4064可以显著增强大黄鱼FXR与RXR过表达促进SHP启动子活性的能力。上述结果初步表明，CDCA和GW4064可作为大黄鱼FXR的有效配体，影响FXR对靶基因的调控。 2.饲料添加鹅去氧胆酸对摄食高脂或高比例豆油饲料大黄鱼生长性能、体组成和抗氧化力的影响 以10.03±0.02g的大黄鱼幼鱼为研究对象，在摄食尚脂或尚比例显油伺料条件下，研究饲料添加FXR天然配体鹅去氧胆酸（CDCA)对大黄鱼生长性能、体组成和抗氧化力的影响。对于高脂实验，以12%脂肪水平组（添加6%鱼油，适宜脂肪水平）为对照组，18%脂肪水平组（添加12%鱼油）为高脂组，并在高脂组基础上分别添加300mg/kg和900mg/kgCDCA。对于高比例豆油实验，以鱼油组（添加6%鱼油，12%脂肪水平）为对照组，豆油组（添加6%豆油，12%脂肪水平）为植物油组，并在豆油组基础上分别添加300mg/kg和900mg/kgCDCA,配制实验饲料，进行10周摄食生长实验。 实验结果表明，存活率在各处理组间没有显著差异。高脂实验中，与适宜组相比，高脂组和高脂基础上添加CDCA对大黄鱼生长没有显著影响。高脂饲料显著提高鱼体粗脂肪、肝脏脂肪含量和肌肉脂肪含量。与高脂组相比，添加300和900mg/kgCDCA可分别显著降低摄食高脂饲料引起的鱼体粗脂肪和肝脏脂肪沉积，但对肌肉脂肪含量没有显著影响。在植物油实验中，与鱼油组相比，摄食高比例豆油饲料组生长显著下降，在豆油基础上添加CDCA可以缓解摄食高比例豆油引起的生长降低。摄食豆油饲料对鱼体粗脂肪和肌肉脂肪含量没有显著影响，但造成肝脏脂肪沉积量显著增加。在豆油组饲料基础上添加900mg/kgCDCA显著降低豆油引起的肝脏脂肪沉积。此外，同适宜脂肪水平组相比，高脂组MDA含量显著升高。与高脂组相比，添加CDCA900mg/kg显著降低了MDA含量，而SOD、CAT活力和GSH含量在各组间均无显著差异。同鱼油组相比，摄食豆油组肝脏SOD活力、MDA和GSH含量没有显著变化，仅CAT活力出现明显下降。在豆油组基础上添加900mg/kgCDCA时，SOD活力与GSH含量显著高于豆油组，而CAT活力无显著变化，MDA含量有降低趋势，但差异不显著。上述结果表明，饲料中添加一定量的FXR天然配体CDCA可以缓解摄食高脂饲料和高比例豆油饲料引起的脂肪异常沉积，并对高比例豆油饲料引起的生长抑制具有缓解作用，但其缓解脂肪异常沉积机制还需进一步探究。 3.FXR对大黄鱼肝脏脂肪代谢的影响和调控机制 针对上述研究出现的摄食高脂和高植物油饲料后，脂肪异常沉积的状况，本实验拟在此基础上，通过在体实验（尚脂实验）和尚体结合，探究大黄鱼FXR的激活对脂代谢的影响与机制。在体实验结果显示，与适宜脂肪水平组相比，高脂组肝脏甘油三酯含量显著升高，在高脂组饲料基础上添加CDCA900mg/kg显著降低肝脏甘油三酯含量。饲料中添加CDCA促进了摄食高脂饲料大黄鱼肝脏SHP的表达，降低了脂肪合成相关基因胆固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)的mRNA和蛋白水平以及脂肪酸合成酶（FAS)的基因表达。离体结果显示，GW4064或CDCA孵育可以显著降低大黄鱼原代肝细胞甘油三酯含量。2μMGW4064和50μMCDCA处理提高了大黄鱼原代肝细胞SHPmRNA和蛋白水平，降低了大黄鱼原代肝细胞肝X受体a(LXRa)、SREBP1和FAS的表达。在FXR敲降后，大黄鱼原代肝细胞SHP表达量降低，而SREBP1和FAS的表达量升高。双荧光素酶实验结果显示过表达大黄鱼LXRa可以促进SREBP1启动子活性，进一步验证了SREBP1受LXRa的调控作用。而过表达大黄鱼SHP可以显著降低过表达LXRa对SREBP1启动子活性的促进作用。并且LXRa激活剂GW3965与FXR激动剂GW4064或CDCA的共同孵育大黄鱼原代肝细胞结果显示，FXR激活降低了LXRa激活诱导的SREBP1、FAS和硬脂酰辅酶A去饱和酶（SCD-1)的表达。结合先前研究发现大黄鱼FXR对SHP具有调控作用，结果表明大黄鱼FXR的激活可能通过SHP的作用抑制SREBP1的表达，降低脂肪合成相关基因表达，进而缓解脂肪异常沉积。 除对脂肪合成的影响，在体实验结果表明，与高脂组相比，添加CDCA提高了肝脏游离脂肪酸含量，促进了肝脏脂肪分解相关基因过氧化物酶体增殖物激活受体a(PPARa)mRNA和蛋白水平及肉碱棕榈酰转移酶1(CPT1)的基因表达。离体实验结果显示CDCA和GW4064孵育可以促进大黄鱼原代肝细胞脂肪分解相关基因PPARa、CPT1、乙酰辅酶A氧化酶（ACO)和脂肪甘油三酯脂肪酶（ATGL)的基因表达，提高PPARa蛋白水平，而FXR敲降后大黄鱼原代肝细胞PPARa、ACO和ATGL表达量降低。双荧光素酶实验和Chip-PCR实验结果显示，大黄鱼FXR与PPARa启动子区存在结合，过表达大黄鱼FXR与RXR可以促进PPARa启动子活性，并且CDCA和GW4064可增强FXR与RXR对PPARa启动子的调控。结果表明，大黄鱼FXR的激活可能通过促进PPARa和ATGL表达，促进甘油三酯水解和脂肪酸氧化，降低甘油三酯含量，缓解脂肪异常沉积。另外，对大黄鱼肝脏脂肪转运相关影响，在体实验结果表明，与高脂组相比，添加CDCA提高了肝脏脂肪转运相关基因低密度脂蛋白受体（LDLR)、微粒体甘油三酯转移蛋白（MTP)和载脂蛋白B100(ApoB100)mRNA水平。离体实验结果显示CDCA和GW4064孵育可以促进LDLR、CD36、MTP和ApoB100的mRNA水平，而FXR敲降后大黄鱼原代肝细胞LDLR和CD36mRNA水平显著降低，ApoB100mRNA水平显著升高，MTP变化不显著。上述结果表明，大黄鱼FXR的激活可能同过影响转运相关基因表达，影响脂肪转运，进而影响脂肪沉积。 4.FXR对大黄鱼炎性反应的影响及调控机制 针对上述研究出现的摄食高豆油油饲料后大黄鱼生长下降的现象，本实验拟在此基础上，结合上述摄食生长实验（在体实验），利用大黄鱼原代肝细胞和大黄鱼肾细胞系（PCK细胞）探究大黄鱼FXR对炎性的影响和调控机制。在体实验结果表明，与鱼油组相比，摄食高比例豆油组大黄鱼的肝脏、头肾、肠和脾组织的肿瘤坏死因子a(TNFa)、环氧化酶-2(COX-2)、白细胞介素1p(IL-1P)和白细胞介素6(IL-6)这些促炎因子表达显著升高。而在豆油组基础上添加CDCA可以缓解大黄鱼肝脏、头肾、肠和脾脏组织促炎基因的表达。同时，摄食高比例豆油饲料大黄鱼NF-kB通路中IKKa/p和IkBa蛋白磷酸化水平和核内P65蛋白水平显著高于鱼油组及CDCA添加组。离体实验中，通过亚油酸（LA)和脂多糖（LPS)孵育大黄鱼原代肝细胞和PCK细胞系模拟摄入高比例豆油和诱发炎性反应的状态，探究FXR对大黄鱼炎性反应的影响。结果表明LA和LPS孵育引起大黄鱼原代肝细胞和PCK细胞促炎相关基因TNFa、COX-2、IL-1P和IL-6的表达显著升高。而通过FXR天然配体CDCA和合成激活剂GW4064的预处理可以缓解LA和LPS诱导的大黄鱼原代肝细胞和PCK细胞中促炎相关基因的表达。而对FXR进行敲降，加剧了LPS诱导的大黄鱼原代肝细胞和PCK细胞中促炎相关基因的表达。进一步通过免疫共沉淀和双荧光素酶实验，发现大黄鱼FXR可与P65结合，过表达大黄鱼FXR抑制NF-kB的转录活性。上述结果表明，大黄鱼FXR的激活可通过FXR与NF-kB的结合作用，抑制NF-kB转录活性，降低促炎相关基因的表达，从而缓解机体炎性反应。
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