摘要
现代真菌基因组学研究表明，真菌中含有大量编码次级代谢产物的基因簇在实验室培养条件下处于沉默状态；如何成功激活这些沉默基因使之表达，已成为挖掘真菌次级代谢产物潜能，获得结构新颖、高效生物活性化合物的国际热点。 化学表观遗传修饰的方法利用到真菌次级代谢产物发掘，激活沉默基因表达已被证明是一种非常简单有效的方法。其中，通过向真菌培养基中添加表观遗传试剂，例如DNA甲基转移酶抑制剂（5-氮杂胞苷）、组蛋白去乙酰化酶抑制剂（SAHA），成功的获得了大量原始条件下不产的新结构类型、高生物活性的化合物。 为充分挖掘实验室菌株库中红树林来源真菌的次级代谢产物潜力，获得结构新颖、高效生物活性的化合物，本论文将采用化学表观遗传修饰这种有效激活沉默基因表达的方法对所选取的红树林来源真菌代谢潜能进行挖掘。首先，利用表观遗传试剂SAHA（伏立诺他）、5-氮杂胞苷作为筛选试剂，结合菌株形态变化初筛及其次级代谢产物HPLC复筛的方法，从选取的10株福建红树林来源真菌中筛选获得了1株敏感菌株（Penicilliumvariabile，添加表观遗传试剂之后代谢产物变丰富）。其次，通过优化最佳的抑制剂添加条件，发现该菌株在含有5-氮杂胞苷（200μM）的真菌2#培养基中，能够产生原始条件没有的化合物；在另一含有SAHA（300μM）的PDB培养基中，原始次级代谢产物产量被大大提高，同时也检测到多个新出现的化合物。最后，对确定的两个最佳发酵条件进行大规模发酵，获得添加抑制剂之后的菌株代谢产物的粗提物。 对该菌株粗提物浸膏进行分离，利用常规柱色谱、MPLC和HPLC等分离手段从添加5-氮杂胞苷规模发酵条件中分离得到了1个新化合物（1），从添加SAHA规模发酵条件中分离得到了18个化合物；其中5个化合物（2-6）为原始条件下所产化合物，10个化合物（7-14、18-19）为添加抑制剂后新出现的化合物，3个化合物（15-17）为分离过程中衍生化合物。 综合运用波谱技术、ECD技术、化学转化及Mosher法等技术阐明了分离得到的19个化合物的结构，其中包括生物碱类（1），该化合物为scyphostatin类含氯半缩酮类化合物；四烯内酯类（2-4、7-17），包括wortmannilactones类化合物非对映异构体（2-4、7-8），含有该类化合物罕见的六元半缩醛环结构的化合物（9-10），发现了该类化合物桥环脱甲基衍生物（11、13），氢化吡喃开环化合物及其他衍生物（12、14-17）；三烯内酯类（18-19），发现了coccidiostatin类含有共轭三烯片段的化合物（18-19）；以及嗜氮酮类（5-6）。运用化学衍生，Mosher法及手性HPLC分析方法，阐明了化合物1的绝对构型；运用化学还原和Mosher法对2和11的桥环结构片段的绝对构型进行了确定；同时，运用ECD及量子化学计算的手段确定了化合物18和19的绝对构型。 活性测试显示，化合物1对结肠癌HCT-116细胞株具有一定的抑制活性，IC50在2.8μM，同时还表现出一定的酪氨酸蛋白激酶抑制活性。其他化合物活性正在测试中。 本论文通过表观遗传试剂添加的方法，获得一株对表观遗传试剂敏感的红树林来源真菌Penicilliumvariabile。添加表观遗传试剂之后，从该菌株中共分得19个化合物，其中新化合物17个；并获得了原始条件不存在的化合物：首个scyphostatin类天然来源含氯半缩酮化合物，wortmannilactone类含有罕见六元半缩醛结构的衍生物，以及coccidiostatin类三烯衍生化合物等。这些结构新颖且添加抑制剂之后新出现的化合物表明形态初筛结合HPLC复筛这种快速、有效获得敏感菌株方式的意义所在，以及化学表观遗传修饰在真菌次级代谢产物挖掘中的利用价值。
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