摘要
氨氮是对虾养殖水环境中重要的污染胁迫因子，主要由代谢废物、残饵等有机物在微生物氨化作用下产生，渗入血淋巴中产生毒害作用，严重影响对虾生理代谢功能，最终抑制其生长和存活。以往的研究主要集中在病原菌与免疫的关系上，而对环境因子与免疫间关系的研究相对薄弱，更缺乏甲壳动物在环境胁迫下的神经内分泌-免疫调控机制的研究。本文通过氨氮胁迫实验，测定了氨氮胁迫对凡纳滨对虾（Litopenaeusvannamei）神经内分泌因子、血细胞免疫信号通路因子以及相关免疫指标的影响，探讨了凡纳滨对虾在氨氮胁迫下的神经内分泌-免疫网络调控机制。结合离体细胞培养技术，探讨高血糖激素（CHH）和生物胺单一和联合作用对凡纳滨对虾血细胞免疫调控机制的研究。本论文主要内容包括以下两个方面： 1.氨氮胁迫对凡纳滨对虾免疫防御机制的影响 已有研究表明甲壳动物在氨氮胁迫下免疫防御能力下降，对病原菌的易感性明显提高，目前甲壳动物在氨氮胁迫下免疫生理调控机制已成为国内外的热点领域研究。本文以凡纳滨对虾为研究对象，探讨了凡纳滨对虾在氨氮胁迫下神经内分泌-免疫调控的分子机制。实验梯度设置为：对照组（自然海水0.01mg/L）、2mg/L、10mg/L、20mg/L氨氮处理组，实验前对虾（5.5±1.0g）饥饿48h,实验期间不投喂饵料，各实验梯度均设3个平行组，分别于0、3、6、12、24和48h抽取血淋巴。结果表明：氨氮胁迫对凡纳滨对虾血浆生物胺含量、血细胞膜上受体、胞内信号通路因子和免疫防御指标具有显著影响（Plt;0.05），而对照组无明显变化（Pgt;0.05）。血浆多巴胺（DA）、去甲肾上腺素（NE）、5-羟色胺（5-HT）含量及其受体基因表达均在48h内呈现峰值变化，DA-D4型受体、α2-NE受体基因表达在6h时达到最小值，而3种生物胺含量、5-HT受体基因均于6h达到最大值，其中5-HT受体基因表达在48h时恢复至对照组水平，其它均于24h后与对照组无显著差异；CHH膜上受体鸟苷酸环化酶（GC）基因表达的变化趋势与5-HT受体基因表达类似；同时生物胺含量和受体基因表达表现出明显的时间剂量效应，尤其是DA含量和受体基因表达变化最为显著。血细胞内信号通路因子环状腺苷酸（cAMP）、环状鸟苷酸（cGMP）、蛋白激酶A（PKA）、蛋白激酶G（PKG）含量和钙调蛋白（CaM）、蛋白激酶C（PKC）含量分别在12h、24h内呈峰值变化，然后分别恢复至对照组水平，其中PKC含量在6h时达到最小值外，其它均于6h达到最大值；胞内核转录因子环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）和核因子κB（NF-κb）在24h内呈峰值变化，于6h达到最大值，然后趋于稳定，且与对照组无显著差异；信号通路因子和核转录因子均表现出明显的时间剂量效应。血细胞数量、吞噬率和血浆抗菌活力在6h内逐渐降低，之后保持稳定，并明显低于对照组水平；而血浆酚氧化酶活力于3h时明显升高，6h后显著降低，并保持稳定，α2-巨球蛋白含量则在3h内明显下降，6h时显著升高，然后恢复至对照组水平，而且免疫防御指标未表现出明显的剂量效应。由此可见，CHH和生物胺是凡纳滨对虾在氨氮胁迫下2种重要的神经内分泌-免疫调控因子。对虾在氨氮胁迫下膜上多巴胺受体D4、α2肾上腺素能受体、5-HT7受体和GC能分别将生物胺，CHH转导信号至血细胞并影响cAMP,CaM和cGMP的含量，通过调节胞内PKA、PKC和PKG水平，激活核转录因子CREB和NF-κb，最终调控血细胞吞噬、胞吐作用。 2.高血糖激素与多巴胺单独/联合作用对凡纳滨对虾血细胞免疫防御的影响 通过血细胞培养方法，研究了对凡纳滨对虾血细胞在CHH、DA单一和联合免疫作用下免疫调控机制。实验梯度设置为：对照组（加灭菌的PBS）、CHH处理组（0.3μg/ml）和DA处理组（5μM）、DA+抑制剂组（5.0μM+50μM，1:1混合）、CHH+DA组（0.3μg/ml+5μM）、CHH+DA+抑制剂组（0.3μg/ml+5μM+50μM），其中DA抑制剂为舒必利+SCH23390。各实验梯度均设3个平行组，分别于0、1、3、6和12h取样。结果表明：CHH和DA单独和联合作用对凡纳滨对虾血细胞胞内信号通路因子和免疫防御指标影响显著（Plt;0.05），而对照组无明显变化（Pgt;0.05）。除CHH组钙调蛋白（CaM）与对照组无明显差异和DA组环状鸟苷酸（cGMP）含量下降外，在CHH、DA单独和联合作用下血细胞环状腺苷酸（cAMP）、CaM和cGMP含量明显升高，且cAMP为CHH+DA＞CHH、DA，cGMP为CHH＞CHH+DA＞DA，CaM为DA、CHH+DA＞CHH；蛋白激酶A、G、C（PKA、PKG、PKC）含量分别与cAMP、cGMP、CaM变化趋势类似，但PKC为CHH+DA＞DA＞CHH。CHH处理组血细胞吞噬率和血浆抗菌活力在实验时间内表现为显著升高，CHH+DA、DA处理组明显下降，且CHH＞CHH+DA＞DA，血细胞酚氧化酶原和胞吐酚氧化酶活力分别为明显下降、升高趋势，酚氧化酶原为CHH+DA＜CHH＜DA，酚氧化酶活力为CHH+DA＞CHH＞DA。DA+DA抑制剂（Y）组、CHH+DA+Y组细胞通路因子和免疫防御指标变化分别与DA组、CHH组作用结果类似。所有处理组细胞通路因子和免疫防御指标基本在6h后保持稳定。由此可见，对虾神经内分泌因子CHH、DA共同调控血细胞的免疫防御功能（吞噬作用和胞吐作用），CHH能提高对虾的免疫防御能力，而DA与CHH调控作用相反，而且CHH、DA均能促进血细胞胞吐酚氧化酶原，但两者免疫调控作用不同；同时依据已有的相关研究结果和各指标表现出的时间效应性以及CHH+DA、DA+Y组、CHH+DA+Y组的实验结果，推测CHH、DA对血细胞免疫作用途径为：CHH→cGMP→PKG(主要作用)、CHH→cAMP→PKA（辅助作用）；DA→（cAMP→PKA）或（CaM→PKC）（主要作用）、DA→cGMP→PKG（辅助作用）共同调控血细胞吞噬和胞吐作用。
NETL