乳酸菌对凡纳滨对虾生长、非特异性免疫、抗病力及肠道菌群结构的影响研究

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中文摘要：凡纳滨对虾（Litopenaeusvannamei），又称白脚虾、南美白对虾，原产于中、南美洲太平洋沿岸的温暖水域。因为生长快、抗逆性强、适应性强、肉味鲜美等特点，自1988年引进我国之后，快速在沿海和内陆淡水水域推广，养殖范围广泛。但随着对经济效益的追求，养殖密度不断增大，由此造成了很多问题，最显著的是养殖环境恶化，对虾的免疫力下降引起的病害频发。为了预防和治疗对虾的病害问题，大量的抗生素和化学药物被用于对虾养殖业中。经过多年的使用，陆续出现了抗生素的残留和抗药性问题。不仅使用效果变差，含抗生素的养殖废水的大量排放更污染了附近水域，引发生态环境恶化和食品安全等一系列问题。尤其是近年来能对大多数抗生素产生抗药性的“超级细菌”出现，严重威胁到人类的健康。除此之外，因为对病害防控方面的投入提高，养殖成本增加，经济效益下滑。无论从行业现状还是由此带来的食品安全、生态安全等其他问题都迫切要求研究开发绿色环保的抗生素替代品。微生态制剂因为天然、绿色、高效、无污染、无残留等特点，越来越多地被用于养殖业当中。益生菌作为微生态制剂的一大类，因为具有活性，能持续地对养殖动物产生益生作用而得到更多的青睐。本研究以凡纳滨对虾为研究对象，对比研究了在饲料中添加多种乳酸菌（凝结芽孢杆菌、粪肠球菌和嗜酸乳杆菌）对其生长、血清非特异性免疫、抗病力和肠道菌群结构的影响，以期为它们在凡纳滨对虾养殖上的应用提供理论依据和科学指导。 1.凝结芽孢杆菌对凡纳滨对虾生长、非特异性免疫指标及抗病力的影响通过为期42天饲喂添加有不同浓度凝结芽孢杆菌（Bacilluscoagulans,NJ1701）（5.0×109、1.0×1010、5.0×1010和1.0×1011cfu/kg）的对虾饲料，研究凝结芽孢杆菌对凡纳滨对虾幼虾生长、血清非特异性免疫指标及对副溶血弧菌（Vibrioparahaemolyticus）抗病力的影响。结果表明：对虾的成活率均在90%以上，各处理组之间无差异显著（Pgt;0.05）；与对照组相比，各处理组凡纳滨对虾的体重、特定生长率、饲料效率和表观消化率均显著提高（Plt;0.05），其中以凝结芽孢杆菌添加浓度为5.0×109~1.0×1010cfu/kg饲料时效果较佳。不同凝结芽孢杆菌添加浓度对对虾血清非特异性免疫酶活性影响差异较大。其中，1.0×1010cfu/kg添加浓度下，对虾血清中溶菌酶（LSZ）、总一氧化氮合酶（TNOS）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）活性显著高于对照组（Plt;0.05），而5.0×1010cfu/kg添加浓度下，血清酸性磷酸酶（ACP）和碱性磷酸酶（ALP）活性显著高于其他处理组和对照组（Plt;0.05）。添加凝结芽孢杆菌不影响血清超氧化物歧化酶（SOD）活性，血清iNOS活性则随添加浓度的提高而提高，以1.0×1011cfu/kg添加水平下最高。副溶血弧菌攻毒后，凝结芽孢杆菌5.0×109和1.0×1011cfu/kg处理组（分别为40.0%和13.3%）对虾累计死亡率显著低于对照组（66.7%）（Plt;0.05），但1.0×1010和5.0×1010cfu/kg处理组（53.3%）与对照组差异不大（Pgt;0.05）。各处理组之间比较，以1.0×1011cfu/kg处理组对虾累积死亡率为最低。本研究结果表明，饲喂凝结芽孢杆菌可有效促进凡纳滨对虾的生长，提高其血清非特异性免疫水平和对副溶血弧菌的抗病力。以特定生长率为评价指标，凝结芽孢杆菌的适宜添加量为1.0×1010cfu/kg。 2.三种不同乳酸菌对凡纳滨对虾生长、非特异性免疫及抗病力影响的比较研究通过为期42天饲喂添加浓度为1.0×1010cfu/kg的粪肠球菌、嗜酸乳杆菌和凝结芽孢杆菌的对虾饲料，研究三株不同种类的乳酸菌对凡纳滨对虾幼虾生长、血清非特异性免疫及对副溶血弧菌抗病力的影响。结果表明：对虾的成活率均在90%以上，各处理组间无显著差异（Pgt;0.05）；与对照组相比，各处理组的体重、特定生长率、饲料效率和表观消化率均显著提高（Plt;0.05），其中以添加凝结芽孢杆菌的饲料投喂时效果较佳。不同种类的乳酸菌对对虾血清非特异性免疫酶活性影响差异较大。其中，1.0×1010cfu/kg添加浓度下，粪肠球菌组的碱性磷酸酶（ALP）显著高于对照组（Plt;0.05）；嗜酸乳杆菌组的酸性磷酸酶（ACP）活性显著高于对照组（Plt;0.05）；凝结芽孢杆菌组的溶菌酶（LSM）活性显著高于对照组（Plt;0.05）。添加的三株不同种类的乳酸菌组均不影响血清超氧化物歧化酶（SOD）活性、总一氧化氮合酶（TNOS）活性和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）活性。副溶血弧菌攻毒后，粪肠球菌（40%）和嗜酸乳杆菌（6.67%）组对虾累计死亡率显著低于对照组（66.7%）（Plt;0.05），但凝结芽孢杆菌处理组（53.3%）与对照组差异不大（Pgt;0.05）。各处理组间比较，以嗜酸乳杆菌处理组对虾累积死亡率为最低。本研究结果表明，饲喂凝结芽孢杆菌可有效促进凡纳滨对虾的生长，提高其血清非特异性免疫水平和对副溶血弧菌的抗病力。以特定生长率为评价指标，凝结芽孢杆菌（1.0×1010cfu/kg）作为饲料添加剂效果更好。 3.三种不同乳酸菌对凡纳滨对虾肠道菌群结构影响的比较研究通过为期42天饲喂有添加浓度为1.0×1010cfu/kg的粪肠球菌、嗜酸乳杆菌和凝结芽孢杆菌的对虾饲料，研究这三株不同种类的乳酸菌对凡纳滨对虾幼虾肠道菌群结构和多样性的影响。结果表明：基于97%相似性水平划分OTUs的稀释曲线分析，各个样品的序列达到27,000条以上时，OTUs的数量上升趋于平缓，表明样品的序列测序数量可以有效覆盖文库；测序覆盖深度（Coverage）均达到0.999，说明样品中序列未被测到的概率较低，能真实反映样品中微生物实际组成情况。反映群落物种丰度的Ace、Chao1指数和反映群落物种种类和均匀度的Shannon指数方面，添加乳酸菌的三个处理组较对照组高，说明三个处理组凡纳滨对虾肠道菌群丰富度较对照组高，即α多样性较对照组高。在门水平上，四组样品的肠道菌群均包含变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）三个主要的门，与对照组相比，这三个门在三个乳酸菌组的相对丰度各不相同。相对于对照组，变形菌门在三个乳酸菌组的丰度均上升，而厚壁菌门丰度均下降；在纲分类水平上，α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）、Erysipelotrichia纲和黄杆菌纲（Flavobacteriia）在四个处理组凡纳滨对虾肠道内均占据优势地位。与对照组相比，这三个纲在三个乳酸菌组的相对丰度各不相同。α-变形菌纲在粪肠球菌组和嗜酸乳杆菌组的丰度都有所上升，Erysipelotrichia纲在三个乳酸菌组的丰度都有所下降。但通过UPGMA聚类分析发现，嗜酸乳杆菌（RSJ）组与对照组的群落结构组成最相似，其次是凝结芽孢杆菌（NJ）组，和对照组群落结构差异性最大的是粪肠球菌（FCQ）组。NMDS分析结果表明，肠道微生物群落的组成和丰度在凡纳滨对虾食用含有粪肠球菌、嗜酸乳杆菌和凝结芽孢杆菌的饲料后发生明显变化，明显不同于食用基础饲料对虾的肠道菌群。

作者：

王明阳

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关键词：

凡纳滨对虾乳酸菌非特异性免疫肠道菌群生长发育抗病力

授予学位：

硕士

学科专业：

水生生物学

导师：

田相利

学位年度：

2018

学位授予单位：

中国海洋大学

语种：

中文

中图分类号：