摘要
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤以及第二大癌症相关性死亡的病因，其全球发病率呈现逐年上升的趋势，已然成为危害女性健康的头号杀手。乳腺癌的发生发展和性激素水平密切相关，主要因为乳腺肿瘤细胞的生长依赖于雌激素的驱动作用。在四种分子分型中，雌激素受体（Estrogenreceptor,ER）阳性乳腺癌患者占比约70%，内分泌治疗对于这部分患者极其重要。他莫昔芬是一类选择性的ER调节剂，其通过竞争结合ER来拮抗雌激素对乳腺癌细胞增殖的促进作用，从而发挥抗肿瘤效应。近30年来，他莫昔芬已成为绝经前乳腺癌内分泌治疗的主要药物，它可以显著改善总体生存期和无病生存期。然而，仍有30-50%接受他莫昔芬治疗的患者不能从中获益，这主要归因于原发性和继发性他莫昔芬耐药。因此，研究他莫昔芬耐药相关的分子机制具有重要的意义。 目的 1.探讨CLEC3A在ER阳性乳腺癌他莫昔芬耐药细胞及组织中的差异表达，以及明确CLEC3A表达水平与他莫昔芬敏感性之间的关系。 2.研究CLEC3A在ER阳性乳腺癌他莫昔芬耐药细胞中的分子功能。 3.明确CLEC3A在ER阳性乳腺癌他莫昔芬耐药细胞中的作用机制。 方法 1.我们用低浓度4羟基他莫昔芬（他莫昔芬的活性代谢产物）（4-hydroxytamoxifen,4OHT）持续诱导MCF7和T47D细胞获得具有他莫昔芬耐药性的MCF7R和T47DR细胞。通过倒置相差显微镜观察4OHT诱导前后细胞的形态差异，以及CCK-8实验检测4OHT对MCF7、MCF7R、T47D和T47DR细胞的抑制效率来验证耐药细胞是否诱导成功。 2.利用RT-qPCR和westernblot分别检测他莫昔芬敏感细胞和耐药细胞中CLEC3AmRNA及蛋白的表达水平。与此同时，我们还收集7对配对的他莫昔芬治疗后复发患者的原发及复发病理组织，通过免疫组织化学染色（Immunohistochemistry，IHC）来评估原发和复发病理组织中CLEC3A的蛋白表达水平。 3.在CLEC3A丰度相对较低的MCF7和T47D中转染CLEC3A过表达质粒增加CLEC3A的表达，同时利用小干扰RNA（SmallinterferingRNA，siRNA）在CLEC3A丰度相对较高的MCF7R和T47DR中敲低CLEC3A的表达。然后，通过CCK-8实验，平板克隆形成实验来验证CLEC3A对MCF7和T47D细胞增殖及凋亡的影响。接着，继续采用CCK-8实验和平板克隆形成实验来检测CLEC3A敲低是否改变4OHT对细胞增殖的抑制能力。此外，还通过流式细胞术和westernblot来检测CLEC3A敲低是否影响4OHT对细胞凋亡的促进作用以及凋亡相关蛋白的表达。最后，通过划痕实验和Transwell实验来探究CLEC3A对乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响。 4.CLEC3A在ER阳性乳腺癌细胞中的作用机制尚不明确，我们通过westernblot检测CLEC3A敲低/过表达对PI3K/AKT通路活性的影响。利用MK2206抑制AKT的激活进行表型回复实验来验证CLEC3A与PI3K/AKT通路之间的关系。 结果 1.耐药细胞MCF7R/T47DR与其对应的亲本细胞MCF7/T47D存在着明显的形态学差异，表现为耐药细胞轮廓更为圆滑，近似球形，而其亲本细胞更近似于纺锤形。此外，同等浓度4OHT处理条件下耐药细胞的存活率显著高于亲本细胞。 2.RT-qPCR和westernblot结果显示，与对应的亲本细胞MCF7/T47D相比，CLEC3A在耐药细胞中mRNA和蛋白的表达水平都显著升高。而且，通过IHC评估配对肿瘤组织中CLEC3A表达水平，发现与原发肿瘤组织相比，CLEC3A蛋白在他莫昔芬治疗后复发肿瘤组织中的表达水平显著升高。 3.（1）RT-qPCR和westernblot结果显示，与对照组相比，siRNA可稳定下调MCF7R/T47DR细胞中CLEC3A的表达水平。CLEC3A过表质粒可显著提升MCF7/T47D中的CLEC3A表达。 （2）与对照组相比，MCF7R/T47DR中敲低CLEC3A的表达后4OHT对细胞增殖抑制率明显上升，而且4OHT对细胞凋亡的促进作用明显增强，同时CLEC3A表达水平的改变使凋亡相关标志物的表达水平也出现相应改变。与对照组相比，MCF7/T47D中过表达CLEC3A后细胞增殖率上升，凋亡率下降，而且凋亡相关标志物的表达水平发生相应变化。 （3）划痕实验结果显示，与对照组相比，MCF7R中CLEC3A敲低对细胞迁移速度无明显改变。同样，Transwell迁移实验结果显示MCF7R中CLEC3A敲低对穿出小室的细胞数目没有明显改变。Transwell侵袭实验结果显示CLEC3A敲低组与对照组穿出的细胞数目无明显差异。 4.CLEC3A对ER阳性乳腺癌细胞促进增殖和抑制凋亡的作用可被AKT抑制MK2206部分逆转，敲低CLEC3A的同时应用AKT抑制剂可最大程度地降低ER阳性乳腺癌细胞的存活率并提升凋亡率。 结论 1.与各自对应的亲本相比，MCF7R/T47DR细胞发生了明显的形态改变并且对他莫昔芬产生了耐药性。 2.与亲本细胞相比，MCF7R/T47DR细胞中CLEC3AmRNA和蛋白表达水平显著升高。此外，与内分泌治疗前的原发肿瘤组织相比，治疗后发生他莫昔芬耐药的肿瘤组织中CLEC3A蛋白水平显著升高，表明CLEC3A与ER阳性乳腺癌他莫昔芬耐药密切相关。 3.利用CLEC3A过表达质粒获得了CLEC3A过表达的MCF7/T47D，利用siRNA成功获得了CLEC3A敲低的MCF7R/T47DR细胞。在MCF7/T47D细胞系中CLEC3A促进细胞增殖并抑制细胞凋亡。在MCF7R和T47DR细胞中，敲低CLEC3A可增强他莫昔芬对细胞增殖的抑制能力和促凋亡能力。然而，敲低CLEC3A不影响耐药细胞的迁移和侵袭。 4.在CLEC3A过表达的MCF7/T47D细胞中，CLEC3A不改变PI3K/AKT的表达水平，但改变了PI3K/AKT的磷酸化状态，从而使该通路活性增强。在MCF7/T47D细胞中过表达CLEC3A所产生的表型改变可以被AKT抑制剂MK2206部分逆转。CLEC3A通过PI3K/AKT通路调节ER阳性乳腺癌细胞的增殖，凋亡和他莫昔芬耐药。
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