摘要
鱼类性腺发育和配子发生作为复杂的生物学过程，不仅受相关基因时空表达的调控，而且受神经内分泌系统的支配。长久以来，关于鱼类生殖发育分子机制的研究都备受瞩目。PIWI（Piwi-interactingRNA）蛋白是Argonaute蛋白家族Piwi亚家族的成员，主要表达于生殖系细胞中。大量的研究表明，Piwi基因在动物生殖系统发育中发挥重要作用。它们广泛参与原始生殖细胞的形成、生殖干细胞的维持、卵子发生和精子发生等生理过程。此外，下丘脑-垂体-性腺轴（HPGaxis）作为一种神经内分泌系统同样控制着鱼类的性腺发育过程。那么大菱鲆HPG轴是否对Piwi基因有调控作用？是本论文要探讨的问题。本研究有助于增进对鱼类生殖系统调控的理解，为进一步了解鲽形目鱼类Piwi基因的生理功能奠定良好的理论基础。 本研究首次分析了大菱鲆Piwil1基因和Piwil2基因的基因结构特征和表达模式，并分别研究了HPG轴相关激素（hCG、E2和MT）对雌鱼和雄鱼Piwi基因的调控作用。具体内容如下： 1.大菱鲆Piwil1基因的克隆及表达模式分析 Piwil1基因全长2950bp（GeneBank登陆号：KY349112），5’UTR151bp，开放阅读框ORF2559bp，3’UTR240bp，其中ORF预计编码852个氨基酸并包含Piwi亚家族特征性PAZ结构域和PIWI结构域。同源比对发现大菱鲆PIWIL1蛋白与硬骨鱼PIWIL1蛋白具有较高的同源性，约为77%~80%。基因结构比对发现从两栖类到鱼类，包括大菱鲆在内的物种，Piwil1基因均含有21个外显子和20个内含子。说明大菱鲆Piwil1基因在基因结构进化上高度保守。组织定量及原位杂交结果显示，Piwil1mRNA主要在性腺中表达，在卵巢中主要定位于卵原细胞和各时期卵母细胞的细胞质中，在精巢中主要定位于精原细胞和精母细胞中，而在精细胞中无信号。在胚胎发育阶段，Piwil1基因为母源性表达，随着卵裂的进行，表达量逐渐升高，到桑椹胚时期达到最高，低囊胚期骤然降低，直到孵化期均保持较低的水平。这些结果说明Piwil1基因在性腺和胚胎发育过程中发挥重要作用。 2.大菱鲆Piwil2基因的克隆及表达模式分析 Piwil2基因全长3629bp（GeneBank登陆号：KY123251），5’UTR80bp，ORF3207bp，3’UTR342bp，其中ORF预计编码1068个氨基酸，同样包含PAZ结构域和PIWI结构域。同源比对、基因结构比对及系统进化树分析结果显示Piwil2基因在序列特征和进化上高度保守。对Piwil2基因启动子区转录因子结合位点预测发现，启动子区存在大量与性腺发育、干细胞发育及激素合成相关的转录因子结合位点，推测Piwil2基因可能参与相关的调控过程。qRT-PCR结果显示，Piwil2基因大量表达于精巢和卵巢中，且在卵巢中的表达量显著高于精巢。原位杂交结果显示，Piwil2mRNA在卵巢中主要定位于卵原细胞和各时期卵母细胞的细胞质中，在精巢中主要定位于精原细胞和精母细胞中。胚胎发育时期表达结果显示，Piwil2基因为母源性表达，随着卵裂的进行，表达量逐渐升高，到低囊胚期达到最高，原肠早期急剧降低，直到孵化期均保持较低的水平。说明Piwil2基因在性腺和胚胎发育中同样发挥重要作用。另外，经预测发现Piwil2基因启动子区存在1个CpG岛，通过亚硫酸氢钠测序技术，发现该CpG岛的甲基化水平在卵巢中显著高于精巢。说明甲基化可能参与调控Piwil2基因的表达。 3.HPG轴对Piwi基因的调控分析 为了探究HPG轴对Piwi基因表达的影响，选取hCG、E2和MT三种HPG轴相关激素对大菱鲆雌鱼和雄鱼分别从个体水平和细胞水平进行刺激实验。 在雌鱼中，体内和体外实验均显示hCG对卵巢Piwi基因的表达具有抑制作用；E2作为卵巢hCG的下游激素，对卵巢Piwi基因的表达同样起抑制作用；而雄激素MT对卵巢Piwi基因的表达起促进作用。在雄鱼中，体内和体外实验显示hCG对精巢Piwi基因的表达具有促进作用；MT作为精巢hCG下游激素，对精巢Piwi基因的表达在体内实验中表现为抑制作用，而体外实验中表现为促进作用；雌激素E2对精巢Piwi基因的表达具有明显的抑制作用。总的来说，Piwi基因的表达受HPG轴的调控，这可能与其参与性腺发育和配子发生过程相关。
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