摘要
甜菊（SteviarebaudianaBertoni）为新兴的天然高甜度低热量糖源植物，其高含量糖苷等种质资源研究与优良新品种培育对甜菊产业稳定健康发展始终具有重要的意义和价值。目前的研究已证明，甜菊糖苷的生物合成途径为甜菊糖苷与内源赤霉素共享的MEP途径，直至共同前体内根-贝壳杉烯酸（ent-kaurenoicacid,ent-KA）的合成。ent-KA在内根-贝壳杉烯酸氧化酶（ent-kaurenoicacidoxidase,KAO）的作用下参与赤霉素合成，而经内根-贝壳杉烯酸羟化酶（ent-kaurenoicacid13-hydroxylase,KA13H）合成的甜菊醇则是甜菊糖苷各种组分的苷元。因此，SrKA13H是甜菊糖苷生物合成过程中的关键酶，该酶的相关研究可为进一步探明甜菊糖苷的生物合成过程，以及通过提高甜菊植物体中甜菊醇含量进而提高甜菊糖苷含量的甜菊育种等工作奠定基础。本论文主要包括：甜菊植物叶片中SrKA13H酶的分离与酶活特性分析；不同甜菊品种及不同生长发育期（快速生长期、现蕾期和盛花期）SrKA13H酶活性与甜菊糖苷含量积累的相关性分析。主要研究内容和结果如下： 1、采用40%~50%硫酸铵沉淀、透析除盐等方法对甜菊SrKA13H酶进行分离纯化。应用贝壳杉烯酸（KA）为底物的体外酶促反应体系，以辅酶NADPH的消耗反映提取得到的SrKA13H酶活性。反应组剩余NADPH的OD值明显低于空白对照组，表明提取的SrKA13H酶具有一定活性。经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测为单一条带，得到该酶的亚基分子量约为39KDa。 2、采用C18反相色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）为固定相，乙腈：10mmol/L磷酸缓冲液（32:68）为流动相，测定SrKA13H酶体外酶促反应体系中底物KA的剩余量，KA浓度与峰面积在2~10mg·mL-1范围内呈线性关系。为以底物KA的消耗反映SrKA13H酶活性提供了基础。 3、以底物KA的消耗可以反映SrKA13H酶的活性。SrKA13H酶体外酶促反应体系最适条件为：100μL1mg·mL-1KA溶液，100μL的2.5mg·mL-1NADPH，100μL的SrKA13H酶液混合，用50mmol·L-1磷酸盐缓冲溶液（pH=7.8）调反应体系至1mL。混合物于30℃反应15min。并运用SrKA13H酶体外酶促反应体系，考察了SrKA13H酶的保存条件、反应温度、反应pH等因素对SrKA13H酶活性的影响。结果均表明，优化后的SrKA13H酶体外酶促反应体系，具有灵敏、稳定、可靠的特征。 4、SrKA13H酶作为甜菊糖苷合成途径的第一个关键酶，与最终合成的总苷含量有密切的关系。SrKA13H酶活性虽然与总苷含量有密切的关系，但是在高甜菊苷（Stevioside，ST）含量的品种中，SrKA13H酶活性和ST含量相关性较大，在高莱鲍迪苷A（RA）含量的品种中，SrKA13H酶活性则与RA含量相关性较大。这其中，由ST到RA转化的路径中，是哪些因素在起作用，值得进一步探究。 对SrKA13H酶相关的研究有助于探索如何利用该关键酶来提高甜叶菊叶片中糖苷的含量，为进一步提升甜菊种质品质提供理论依据。
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