摘要
温敏水凝胶是一种能对外界温度做出反应的水凝胶，随温度的变化能够实现溶胶-凝胶的可逆相转变。应用于生物医学领域的温敏水凝胶应具备生物降解性、生物相容性、可注射性和适当的成胶温度。根据这些特性，可在其低温溶液状态下，均匀混入药物、细胞、蛋白、基因、抗原等活性物质，注射到生物体内，在体温下快速凝胶化起到递送缓释的作用。目前，温敏水凝胶在组织工程、药物递送缓释、防组织粘连等方面发挥着巨大作用。 壳聚糖（CS）是一种天然的碱性多糖，自然界中储量丰富，制备工艺成熟，价格低廉。壳聚糖还具有良好的生物相容性和生物降解性，具备成为一种优异生物材料的潜力。本课题以壳聚糖为原料，对其进行化学改性，成功开发出一种新型温敏水凝胶。通过多种手段对这种新型材料进行表征，探究其分子结构、物理化学性质。设计实验研究其生物相容性、生物降解性，并将其作为新城疫疫苗佐剂应用到实际生产中。主要研究内容如下： 1.以壳聚糖为原料，采用冷冻爆破法在浓碱溶液中活化壳聚糖分子上的反应位点。使用1,2-环氧丙烷作为接枝剂，在壳聚糖分子上引入羟丙基，获得水溶性良好的羟丙基壳聚糖（HPCS）。再以己酸酐为接枝剂，在HPCS的2-NH2位点引入一定量的己酰基，最终获得两亲性的N-己酰基羟丙基壳聚糖（HCHPCS）。对合成产物HCHPCS进行表征，以红外光谱、有机元素分析确定其结构特征。其中羟丙基化反应在壳聚糖的羟基和氨基上都有发生，取代度为2.5，酰化反应主要发生在2-NH2，取代度为0.36。将HCHPCS溶于水中，配制5%的HCHPCS溶液，以流变仪测定发生溶胶-凝胶相转变的温度为22℃，凝胶-溶胶相转变的温度为16℃。将该温敏水凝胶在人体温度（37℃）下形成的凝胶后迅速冷冻干燥，使用扫描电镜（SEM）观察其内部形貌。 2.对改性壳聚糖进行生物相容性和生物降解性评价。将辐照灭菌的HCHPCS溶于细胞培养基中，配制成125μg/mL、250μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL、2000μg/mL五个浓度的细胞培养基，用于培养小鼠成纤维细胞L929。分别于24、48、72h三个时间点，采用MTT法计算相对细胞增殖率。各个浓度下的细胞生长状况良好，且相对细胞增殖率均在95%以上，细胞毒性评级为0级或1级，展现出良好的细胞相容性。将200μL水凝胶注射到SD大鼠的背部皮下和腿部肌肉中，使其快速原位成胶。每周处死一组SD大鼠，观察水凝胶的降解情况和炎症反应，并取凝胶周围组织，制备组织切片进行病理学观察。结果显示，植入水凝胶后，第1w出现轻微炎症，之后逐渐减轻至恢复正常，说明水凝胶具有良好的组织相容性。肌肉和皮下的水凝胶分别于植入后第5w和第6w降解。综上所述，该改性壳聚糖水凝胶具有良好的生物相容性和生物降解性，可应用于生物医学领域。 3.将温敏水凝胶用作鸡新城疫疫苗的佐剂制备疫苗，以生产中常用的白油佐剂疫苗作为对照，按照标准量注射到14日龄SPF鸡的颈部皮下。免疫后，每周从SPF鸡的翅静脉取血，用于血凝抑制试验（HI）检测血清抗体效价。结果显示，2%和3%HCHPCS佐剂疫苗组抗体效价能够达到免疫保护水平（4log2），持续时间分别为5w和3w，但免疫效果和持续时间都低于白油佐剂疫苗组。 综上所述，HCHPCS是一种具有良好生物相容性、生物降解性的可注射温敏水凝胶，充分开发其潜能，能够广泛应用于生物医学领域。
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