摘要
黑色素是玉米大斑病菌(Setosphaeriaturcica)侵入寄主的关键致病因子，其合成途径受转录因子StMR1的调控。StMR1蛋白具有独特的Cys2His2和Zn(Ⅱ)2Cys6双锌指结构域。迄今为止，共有6种植物病原真菌的黑色素合成调控基因被成功克隆，均编码同一类转录因子，转录因子可以与DNA特异结合来行使转录功能。对转录因子DNA结合的特异性表征是解析转录因子调控功能及进化的关键，然而对该类转录因子如何调控DHN黑色素合成和调控的靶位点知之甚少。本研究在前期获得StMR1基因缺失突变体的基础上，首先创制StMR1基因回补菌株，进一步证明StMR1与DHN黑色素合成关系;通过酵母单杂交技术验证StMR1和黑色素合成途径中关键基因间的直接调控关系，MEME预测StMR1特异结合的DNA基序，该结果可为StMR1调控玉米大斑病菌黑色素合成的分子机制研究奠定基础。 主要研究结果如下: 1.以质粒pBS和3FLAG+6HA-pUC57为骨架，以草铵膦(Bar)为抗性筛选基因，利用同源重组原理，构建了StMR1基因的回复载体，通过原生质体转化的方法在已有的敲除突变体△Stmr1的基础上创制了基因回补菌株C.△Stmr1-1和C.△Stmr1-2。 2.对回补菌株C.△Stmr1-1和C.△Stmr1-2的黑色素产生能力和侵染能力进行分析发现，StMR1基因回复后黑色素合成能力较敲除突变体△Stmr1上升了9-10倍，侵染效能较突变体明显增加。 3.采用实时荧光定量PCR技术对黑色素合成途径中关键基因(StPKS、St3HNR、St4HNR、StSCD、StLAC1和StLAC2)的表达情况进行分析发现，与敲除突变体△Stmr1相比，回补菌株C.△Stmr1-1和C.△Stmr1-2中合成酶基因StPKS，还原酶基因St3HNR、St4HNR，脱水酶基因StSCD和漆酶基因StLAC1、StLAC2的表达量均显著增加，其中St3HNR和St4HNR的基因表达量上升了4-6倍;StSCD上升了2-3倍;StPKS上升了0.8.1倍;StLAC1和StLAC2均上升了1-2倍。 4.通过酵母单杂交技术分析转录因子StMRl与黑色素合成途径关键基因的互作关系，结果发现，StMR1与StPKS、St3HNR、St4HNR和StLAC2基因的启动子区有结合，而与StSCD、StLAC1的启动子区不结合，表明StMR1通过直接调控黑色素合成酶基因StPKS、St4HNR、St3HNR和StLAC2的表达影响玉米大斑病菌黑色素合成。 5.通过MEME在线分析StPKS、St4HNR、册朋性和StLAC2基因启动子区序列特征，预测到StMRl识别的核心序列可能是CAT(G/T)，酵母单杂交试验初步确定该序列与StMRl结合。 6.以与靶基因研尸船结合为例，通过酵母单杂交技术分别验证Cys2His2锌指基序和Zn(Ⅱ)2Cys6锌簇蛋白基序在StMR1调控功能中的作用，结果发现，StPKS-pAbAi只与具有双锌指结构域的AD.StMR1互作，与仅含单结构域的AD.StMR1△C2H2、AD.StMR1△c6和缺失双锌指结构域的AD.StMRl△C2H2，c6均不互作，表明双锌指结构域在StMR1基因功能中是必须的。
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