摘要
乳酸菌分泌的胞外囊泡（EVs）是一种调节畜禽肠道粘膜免疫和保障肠道健康的天然大分子生物递送载体，其可携带免疫调节因子和生物活性物质等功能性分子穿透肠上皮屏障进入基底层与宿主细胞互作。但是将乳酸菌胞外囊泡（EVs）应用于畜禽肠道健康干预中仍存在以下问题：一是EVs携带活性蛋白无特异性；二是其细胞靶向性差。因此，本研究以一种非共价特异性凸面膜结合小肽VM为接头蛋白，将特异性蛋白GFP锚定于天然EVs表面，首次尝试构建乳酸菌胞外囊泡表面展示系统。并利用乳酸菌来源S层蛋白包被表面结合VM-GFP的EVs，将其递送至肠上皮细胞来探究其对肠上皮细胞免疫调节作用的影响。试验结果如下： 1.VM对天然胞外囊泡的靶向结合分析 本试验成功构建VM-GFP真核表达载体，并将VM-GFP真核表达载体成功转染至293T细胞，根据WesternBlot结果证明VM能够在细胞内靶向天然EVs。本试验成功构建VM原核表达载体并纯化出带His标签以及报告基因GFP的VM-GFP-His。将天然胞外囊泡与VM-GFP-His在细胞外进行孵育结合，His-Tag蛋白纯化磁珠检测试验显示EVs在与VM-GFP-His孵育后能够被镍磁珠吸附并被洗脱下来；高分辨率激光共聚焦检测技术对VM细胞外靶向EVs进行可视化研究，结果显示VM-GFP与EVs孵育后能够被293T细胞内在化，表明VM能够在细胞外靶向天然胞外囊泡。 2.VM对不同来源以及不同大小EVs的靶向结合分析 本试验通过超速离心法分离得到罗伊氏乳杆菌、卷曲乳杆菌（分泌S层蛋白）以及牛奶中不同大小纳米颗粒物。透射电镜、NTA和WesternBlot分析显示本试验获得的纳米颗粒物其表征特性与已报道的胞外囊泡特性一致，表明成功分离得到EVs。通过高分辨率激光共聚焦检测技术和His-Tag蛋白纯化磁珠法探究VM与分离得到EVs孵育结合后的靶向情况，结果显示VM能够靶向结合不同乳酸菌来源的EVs，且对于粒径为70nm的胞外囊泡具有靶向偏好性。 3.S层包被VM+EVs对LPS刺激的猪小肠上皮细胞免疫炎症因子表达的影响 本试验采用LPS刺激猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）构建体外细胞炎症模型，探究VM-GFP+EVs在S层的包被下对IPEC-J2细胞炎症应答的调节机制。结果显示：500μg/mLLPS能够降低细胞的活力并引发细胞炎症反应，是构建IPEC-J2细胞体外炎症模型的最佳刺激浓度。适宜剂量的S层+EVs+VM不影响IPEC-J2细胞的存活率，且能够增强抗炎基因IL-4表达水平；抑制促炎基因IL-6、TNF-α的表达水平。 综上所述，本试验探索出：VM-GFP蛋白能够在细胞内以及细胞外靶向结合天然胞外囊泡；能够靶向结合不同乳酸菌来源及不同大小的天然胞外囊泡，且对于粒径为70nm的小囊泡具有靶向偏好性，成功构建出VM-GFP-EVs乳酸菌EVs表面展示系统。除此之外，S层蛋白包被的EVs+VM组分系统能够激活猪小肠上皮炎症因子的表达，具有促炎和抑炎作用，为生物活性分子在动物机体内的高效传递研究提供方法和理论基础。
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