摘要
目的：通过山羊支原体山羊肺炎亚种（Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae,Mccp）感染山羊气管上皮细胞，建立感染方法，可用于实验室鉴定Mccp潜在保护性抗原，为潜在保护性抗原靶标鉴定提供技术手段，为Mccp致病机理研究奠定基础；建立Mccp感染SPF鸡胚的方法，评价Mccp不同菌株毒力，为疫苗用菌株的筛选提供可靠的评价方法。 方法：（1）Mccp感染山羊气管上皮细胞（GTC）间接免疫荧光（IFA）试验：用Mccp感染GTC细胞，Mccp感染山羊康复后血清作为一抗，FITC标记的兔抗山羊IgG为二抗，确定Mccp感染浓度、时间及一抗、二抗工作浓度；建立间接免疫荧光检测方法（IFA）。（2）Mccp感染GTC间接免疫荧光方法的初步应用：使用实验室制备的阳性血清、阴性血清，以及实验室前期反向疫苗学和免疫蛋白组学筛选的与Mccp黏附相关蛋白P161、P87、P42、P200R1、P200R2所制抗血清和混合抗血清与Mccp菌液共孵育，接种GTC细胞，观察特异性荧光强度变化，并用real-time PCR检测各血清与Mccp菌液共孵育后黏附细胞菌量拷贝值，计算黏附率，鉴定这些蛋白对Mccp黏附GTC细胞的阻断/黏附作用，为疫苗研制提供可用的潜在保护性靶标。（3）Mccp感染SPF鸡胚方法的建立及初步应用：使用不同浓度（剂量：0.2mL/蛋）Mccp菌液通过鸡胚卵黄囊和尿囊腔途径，感染不同日龄SPF鸡胚，观察并记录鸡胚死亡情况。采集鸡胚尿囊液和卵黄囊液样品进行Mccp real-time PCR鉴定和分离培养鉴定，确定Mccp感染鸡胚最适接种浓度（剂量：0.2mL/蛋）、接种途径和接种日龄，以及real-time PCR检测和分离培养最佳样品，建立Mccp感染鸡胚方法。利用该方法，将Mccp M1801分离株、M1601分离株、F38标准株和从藏羚羊上分离的ZLY1309F株接种同一日龄SPF鸡胚，统计鸡胚死亡率、real-time PCR检测样品阳性率和样品分离培养鉴定阳性率，比较4株Mccp菌株对鸡胚致病力强弱。 结果：（1）Mccp感染GTC细胞间接免疫荧光方法条件为：黏附滴度为1.5～7.0×107copies/μL（1×106CCU/mL，剂量：0.2mL/蛋），黏附时间为2h，一抗最适工作浓度为1:100，二抗最适工作浓度为1:100。阳性血清阻断Mccp黏附作用，可观察到荧光亮度减弱和黏附率降低。（2）Mccp感染山羊气管上皮细胞（GTC）间接免疫荧光（IFA）方法的初步应用：阳性血清处理Mccp菌液黏附细胞后特异性荧光几乎没有，其黏附率（0.23%和0.27%）相比较阳性血清（黏附率为7.96%和8.58%）也明显下降；P161抗血清、P87抗血清、P42抗血清、P200R1抗血清、P200R2抗血清、混合抗血清阻断孔特异性荧光强度均减少，其中P161荧光减少最明显。各蛋白阻断黏附后黏附率降低由强到弱为P161抗血清（黏附率为1.64%和1.76%）、混合抗血清（黏附率为1.07%和1.47%）、P200R2抗血清（2.03%和2.48%）、P200R1抗血清（黏附率为2.06%和2.65%）、P87抗血清（黏附率为2.28%和2.96%）、P42抗血清(3.44%和4.13%)。从特异性荧光减少和黏附率观察，推测蛋白P161与Mccp黏附密切相关。（3）建立Mccp感染SPF鸡胚试验方法最优条件为：卵黄囊途径接种，接种浓度为1×107CCU/mL（剂量：0.2mL/蛋），接种日龄为7～8日龄，尿囊液为最佳real-time PCR检测和分离鉴定样品。用该方法比较可知M1801株死亡率、real-time PCR检测样品阳性率和样品分离鉴定阳性率均为100%，为4株Mccp中致病力强毒株；M1601（死亡率60%，检测阳性率100%，分离鉴定阳性率50%）次之，最后是F38株（死亡率30%，检测阳性率90%，分离鉴定阳性率70%）和ZLY1309F株（死亡率30%，检测阳性率100%，分离鉴定阳性率70%）。 结论：（1）建立了Mccp黏附GTC细胞的IFA方法，且阳性血清阻断该黏附作用。（2）初步鉴定Mccp P161蛋白具有黏附作用。（3）建立了Mccp感染鸡胚方法，可用于Mccp菌株毒力评价。
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