摘要
内生真菌是一大类生活在健康植物组织内、不引起病害的真菌，其包含的一些深色有隔内生菌(Dark septate endophytes,DSE)具有促生、提高植物抗逆性等功能；此外，一些内生真菌可与植物共生，形成内生菌根，如杜鹃花类菌根真菌(Ericoid mycorrhizal fungi,EMF)。深色有隔内生菌与杜鹃花类菌根真菌侵染植物后，与植物发生复杂的相互作用，引起植物基因、miRNA表达的变化，并产生一些特异代谢产物，但其作用机制尚不明晰。本研究筛选杜鹃花类菌根真菌定殖相关差异表达基因，并利用代谢组学技术筛选菌根真菌定殖相关差异代谢产物。此外，筛选出一株具有产水解酶并具有解磷能力的深色有隔内生真菌菌株，将其接种树莓，分析其对树莓miRNA表达的影响。研究结果如下： (1)基于前期研究中的接种/未接种杜鹃花类菌根真菌越橘转录组测序数据，筛选出78种菌根真菌定殖差异表达基因。设计特异引物，以越橘组培苗为实验材料，提取其总RNA，通过分子克隆，鉴定出12种菌根真菌定殖差异表达基因。将杜鹃花类菌根真菌Oidiodendron maius菌株G5接种至越橘根部，利用荧光定量PCR技术分析12种基因在越橘根、茎、叶中表达量变化。接种三周后，基因CL10770.Contig2_All在茎中富集较高，基因CL4338.Contig1_All在根、茎、叶中的表达量极低；基因Unigene9717_All在根、茎、叶的表达量明显高于对照，其中根的表达量约为对照的14.29倍；基因Unigene9739_All在根、茎、叶的表达水平相对较低。利用代谢组学技术分析了接种/未接种菌根真菌越橘代谢产物的差异，接种三周后共鉴定出636个差异代谢产物，差异代谢产物主要集中于色氨酸代谢和异喹啉生物碱的生物合成。结合菌根真菌定殖差异表达基因及代谢产物分析，推测菌根真菌侵入后，越橘可能调控CL10770.Contig2_All基因的表达，该基因表达诱导越橘促进防御功能的次生代谢产物(如生物碱)积累，可能防止菌根真菌过度增殖，以免耗费大量的养分。 (2)以实验室保存的深色有隔内生真菌Phialocephala fortinii为实验材料，分别测定其蛋白酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、漆酶、磷酸酶活性、pH及可溶性磷含量。结果显示深色有隔内生真菌菌株可产蛋白酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、漆酶以及磷酸酶，其中菌株F5酶活高于其他3个菌株。在以难溶性磷酸钙为唯一磷源时，菌株F5显著提高了发酵液中可溶性磷含量及磷酸酶活性，降低了发酵液的pH，推测菌株F5将发酵液中难溶性磷酸盐转化为可溶性磷源主要依靠磷酸酶的分泌。利用Phialocephala fortinii菌株F5侵染树莓，接种第五周时，叶绿素含量及SOD活性明显高于对照组。说明深色有隔内生真菌菌株F5对树莓具有潜在的促生能力。 (3)以树莓为实验材料，提取其根、茎、叶总RNA，进行高通量测序。共鉴定出147种已知miRNA和542种新miRNA。选取6种代表性miRNA，检测其在根、茎、叶中的表达量。miR408-y在茎和叶中的表达相对更高，miR2118-y和miR171-z在根中有较高富集。miR398-x在叶片中高表达，但在茎中几乎检测不到，miR319-y和miR894-x在叶片中几乎不存在，在茎中表达更显著。以树莓根组织为实验材料，接种深色有隔内生真菌菌株F5，结果显示miR171-z和miR2118-y表达量变化较大，皆在接种菌株F5四周后表达量呈显著增长。初步推断miR171-z和miR2118-y为深色有隔内生真菌定殖相关的miRNA。
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