摘要
背景及目的:抑郁症是一种复杂的慢性疾病，目前抑郁症的发生机制尚不清楚。早期对抑郁症的机制研究都聚焦于遗传因素，但既往研究提示遗传因素对抑郁症进程的影响仅占35％。这表明其他因素在抑郁症的发生过程中可能起到更重要的作用。近年的研究证实环境因素，特别是压力和生命早期的不良生活事件是引发抑郁症的重要因素。目前研究表明环境因素通过影响基因的表观遗传修饰改变而造成抑郁行为的发生。表观遗传学修饰是指影响基因表达但不涉及DNA序列变化的调控机制，目前发现的表观遗传学修饰有甲基化修饰，组蛋白修饰，非编码RNA等修饰。既往的研究证实羟甲基化修饰(5-hydroxymethylcytosine，5hmC)在抑郁行为发生中起重要作用，羟甲基化修饰催化酶Tet2基因敲除可以造成抑郁样行为，但Tet2蛋白在抑郁行为发生的作用机制尚无研究。本论文将探讨Tet2参与抑郁行为发生的作用机制。 方法:首先应用Tet2-loxp小鼠、Nestin-Cre小鼠、立体定位注射Cre病毒以及他莫昔芬药物诱导的方式构建了不同Tet2条件敲除(conditional knock out，CKO)小鼠;分别构建了慢性温和应激抑郁小鼠模型(chronic mild stress，CMS)和慢性社交挫败抑郁小鼠模型(chronic social defeat stress，CSDS);通过悬尾实验和强迫游泳实验检测动物抑郁样行为;利用斑点杂交、Western blot方法、免疫组化方法检测Tet2和5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine，5hmC)的表达变化;提取组织的细胞核核细胞浆组分，检测Tet2在不同组分的改变;利用xx方法进行脑组织的全基因5hmC测序，并对测序结果进行不同分析;应用免疫沉淀和质谱分析技术寻找Tet2蛋白相互作用蛋白。 结果:本研究发现三种不同的Tet2CKO小鼠在悬尾实验和强迫游泳实验中都存在不动时间的显著增加，存在抑郁样行为，提示Tet2参与抑郁样行为的调控。然而奇怪的是，两种不同抑郁模型小鼠中海马组织中Tet2蛋白水平显著高于对照组。通过检测细胞组分中Tet2的变化，研究发现增加的Tet2蛋白积聚于细胞浆内，而没有增加细胞核内Tet2蛋白。由于正常情况下，Tet2蛋白在细胞核内发挥羟甲基化修饰的催化作用，抑郁和应激条件下核内Tet2蛋白的减少会影响其催化作用，这与应激后海马组织内5hmC修饰的总水平降低一致。通过对比和分析Tet2CKO小鼠和应激后小鼠海马组织的全基因组ShmC修饰结果，差异动态羟甲基化位点(DhMLs)变化和生物信息学分析（GO基因功能富集分析和KEGG通路分析）在两种条件下存在一些共同的变化，并且有较高的重叠度，包括与抑郁相关的多个信号通路的改变。这些结果表明Tet2在细胞内分布异常影响Tet2蛋白功能的发挥，调控应激后Tet2蛋白细胞内分布可能改善抑郁行为。为探讨抑郁后Tet2胞核运输障碍的机制，免疫沉淀和质谱分析用来寻找Tet2相互作用蛋白，结果发现Ahi1是Tet2的相互作用蛋白之一。由于Ahi1是一种具有蛋白质核转运功能的蛋白且与抑郁行为相关，因此Ahi1可能是影响Tet2入核的蛋白。Ahi1KO小鼠具有抑郁样表型;在Ahi1KO小鼠海马组织内，Tet2蛋白在细胞质中有异常的积聚;应激条件下脑内Ahi1显著减少。而在细胞实验中，过表达Ahi1增加细胞核内的Tet2，表明Ahi1参与Tet2细胞核内的运输。 结论:不同条件下Tet2敲除都造成小鼠抑郁样行为。Tet2蛋白在应激条件下造成细胞浆的积累和细胞核内分布减少。Ahi1是Tet2的相互作用蛋白，参调控Tet2细胞内的分布和抑郁样行为。因此该研究揭示了Tet2在抑郁行为中的作用以及其细胞内蛋白转运的机制，对于抑郁症发病机制的认识以及抑郁症药物开发提供了新的策略和思路。
NETL