摘要
食管癌（Esophageal Cancer, EC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其5年生存率长期低于20%。食管癌的高度侵袭性与转移往往与预后不良相关。根据病理类型分类：欧美等发达国家主要病理类型为食管腺癌，但是包括中国华北地区在内的“食管癌亚洲地带”主要的病理类型为食管鳞状细胞癌。 尽管手术、放化疗、靶向治疗不断进步，但是仍不能很好地解决食管癌术后复发或转移的问题，严重影响了食管癌患者的生活质量与生存时间。中医药具有多成分、多靶点、系统调控的特点，这对于转移性食管癌的治疗有重要意义。 本团队通过查阅古籍和临床经验总结，提出食管癌的核心病机为“胃脘干槁”，据此确定“甘润濡养”的治疗法则。启膈方（Qigefang，QGF）是李晶教授根据多年临床经验，并结合清代名医程钟龄所著《医学心悟》中启膈散，加减化裁创制而成，是现在广泛用于食管癌治疗的中草药复合物。在大量的临床应用中发现QGF对延缓食管癌术后复发和转移效果显著，并且极少出现明显不良反应。 本研究第一部分通过4NQO诱导C57小鼠构建原位食管癌发生和发展的模型，分析启膈方在小鼠食管癌发生、发展及预后中的作用；第二部分人源食管癌细胞KYSE150通过尾静脉注射于裸鼠体内，构建小鼠食管癌肺转移模型，并探讨启膈方对食管癌细胞迁移、侵袭和运动能力的影响以及启膈方对裸鼠食管癌肺转移瘤生长情况的影响；第三部分鼠源前胃癌细胞MFC通过皮下注射于615小鼠，构建小鼠皮下移植瘤肺转移模型，探讨启膈方在食管癌细胞脱离肿瘤灶，突破基底膜，进入血液循环，定植于肺部的转移过程中的作用。我们的研究为食管癌的治疗提供了新的思路，以及为进一步的药物研发与应用提供依据。 第一部分 启膈方对4NQO诱导C57小鼠食管癌发生、发展的影响 目的： 探讨QGF对4NQO诱导C57小鼠食管癌发生、发展的作用，以及Gas6、Axl蛋白在食管癌发生、发展过程的作用。 方法： 通过诱癌剂4NQO诱导C57小鼠食管癌发生和发展，将所有实验小鼠随机分为空白对照组、单纯4NQO诱癌组和4NQO/QGF组，对照组第1-32周给予饮用水；4NQO诱癌组在1-16周给予浓度为0.1mg/ml的4NQO溶液，16-32周给予饮用水；4NQO/QGF组在1-16周给予4NQO溶液同时加入QGF溶液（浓度3913mg/kg/只/天），16-32周继续给予QGF溶液，实验总共持续32周。通过肉眼观察分析小鼠食管大体改变、H＆E染色检测小鼠食管病理情况，计算小鼠食管癌发生率，并分析小鼠食管病理改变的进展规律；免疫组织化学法检测小鼠食管组织Ki67、MMP-9、Gas6、Axl蛋白表达；Kaplan-Meier生存曲线分析小鼠生存率。 结果： 1.随着诱癌时间延长，小鼠食管逐渐增粗，表面凹凸不平，出现大小不等小结节。 2.H＆E检测小鼠食管病理改变，主要病理类型包括轻度异型增生、重度异型增生、鳞状细胞癌。QGF将小鼠食管癌的发生率从50％降低到25.9％（Plt;0.01），并将重度异型增生和食管癌的合并发生率从78.1％降低到64.9％（Plt;0.01）。 3.随着小鼠食管组织病理改变恶性程度增加，Ki67和MMP-9蛋白的表达也相应增加（Plt;0.001），Gas6和Axl在小鼠食管病理改变中展现出同样趋势（Plt;0.001），且Ki67、MMP-9、Gas6、Axl表达与病理恶性程度呈正相关。 4.Kaplan-Meier生存曲线表明，4NQO/QGF组小鼠与单纯4NQO诱导组相比,小鼠生存率明显提高（Plt;0.05）。 小结： 1.QGF能够延缓4NQO诱导小鼠食管癌发生和发展进程，降低重度异型增生与食管癌发生率。 2.Gas6和Axl在小鼠食管癌形成过程中进行性增高，Gas6和Axl可能与小鼠食管肿瘤发生、发展相关。 3.QGF能够提高4NQO诱导小鼠的生存率。 4.QGF可能通过调节Gas6和Axl蛋白抑制4NQO诱导小鼠食管癌发生与发展，并提高小鼠的生存率。 第二部分 启膈方抑制食管癌细胞KYSE150迁移与侵袭以及肺转移的研究 目的： 通过体外和体内实验，探讨QGF对食管癌细胞KYSE150迁移、侵袭和运动的作用；探讨QGF对裸鼠食管癌细胞肺转移的影响，以及对Gas6、Axl及相关蛋白的调控作用。 方法： 通过CCK-8实验分析KYSE150细胞存活率；通过划痕实验、活细胞工作站、侵袭实验分析细胞的迁移和侵袭能力；通过免疫荧光染色和免疫印迹检测Gas6、Axl、NF-κB、MMP-9在食管癌细胞的定位及表达，进一步探讨QGF通过调控Gas6/Axl在食管细胞迁移、运动与侵袭中的作用。通过小动物活体成像观察小鼠食管癌肺转移瘤荧光强度，大体观察及H＆E染色观察小鼠肺转移瘤数目及面积，免疫印迹检测肺转移瘤Gas6、Axl、NF-κB、MMP-9蛋白表达。 结果： 1.CCk-8实验，QGF处理KYSE150细胞24 h后，结果显示，400μg/ml呈现出细胞毒性作用，当浓度低于200μg/ml时，细胞存活率未受到明显抑制；进而用QGF（200μg/ml）培养KYSE150细胞48h，结果显示，24h内细胞增殖未受到明显抑制。 2.QGF干预KYSE150细胞24小时，与对照组相比，划痕实验结果显示：QGF处理明显抑制了细胞向空白划痕区域的迁移速度（P＜0.01）；活细胞工作站实验结果显示，QGF干预的KYSE150细胞移动速度显著降低（P＜0.01），KYSE150细胞有效移动距离显著缩短（P＜0.01）；侵袭实验结果显示， QGF干预的细胞穿过Transwell小室的数量明显减少（ P＜0.01）。 3.免疫荧光法与免疫印迹实验结果显示：与对照组相比，QGF（200μg/ml）干预后KYSE150细胞的Gas6和Axl表达位置未见明显变化，但相对应位置荧光强度降低，Gas6和Axl蛋白的表达水平显著降低（P＜0.01）。 4.免疫荧光法与免疫印迹实验结果显示：与对照组相比，QGF（200μg/ml）干预后KYSE150细胞的P-NF-κB和MMP-9表达位置未见明显变化，但相对应位置荧光强度降低。P-NF-κB和MMP-9的蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）。 小结： 1. QGF抑制食管癌细胞KYSE150的迁移和侵袭。 2.在食管癌细胞KYSE150中Gas6和Axl高表达，QGF通过调控Gas6和Axl及下游蛋白表达，从而抑制食管癌细胞的迁移和侵袭。 3. QGF抑制裸鼠食管癌细胞KYSE150肺转移瘤生长。 4.QGF可能通过调控Gas6和Axl及下游蛋白表达，从而抑制食管癌细胞KYSE150裸鼠肺转移瘤生长。 第三部分 启膈方抑制615小鼠皮下移植瘤肺转移的研究 目的： 观察QGF对615小鼠皮下移植瘤细胞肺转移的影响，以及QGF对肿瘤组织中Gas6、Axl、NF-κB、MMP-9蛋白表达的抑制作用。 方法： 鼠源前胃癌细胞株MFC皮下注射建立615小鼠皮下移植瘤模型。将接种成功小鼠随机分为生理盐水组和QGF组，分别给予生理盐水和QGF溶液灌胃。每3日测量皮下移植瘤体积和肿瘤重量；通过H＆E及免疫组化染色检测皮下移植瘤病理及MMP-9表达；免疫印迹检测小鼠皮下移植瘤中Gas6、Axl及相关蛋白表达情况；大体观察及H＆E染色检测皮下移植瘤肺转移情况。 结果： 1.测量小鼠皮下移植瘤体积与体重，结果显示：QGF组小鼠肿瘤体积及体重与对照组相比无明显差异（P＞0.05）。 2.免疫组化实验结果显示：MMP-9表达阳性的细胞显示出明显的细胞质染色，QGF能显著降低小鼠皮下移植瘤中MMP-9蛋白表达水平（P＜0.01）。 3.免疫印迹实验果显示：QGF组小鼠肺转移瘤中Gas6、Axl、P-NF-κB和MMP-9蛋白表达水平明显低于对照组（P＜0.05）或（P＜0.01）。 小结： 1.QGF通过抑制前胃癌细胞MFC脱离肿瘤病灶，减少肺转移的发生。 2.QGF可能通过调节Gas6、Axl蛋白表达抑制细胞外基质降解从而抑制前胃癌细胞MFC侵袭和转移。 结论： 1. Gas6和Axl在4NQO诱导小鼠食管癌进程中的表达及活性显著增加，并且Gas6和Axl的表达与肿瘤标志物Ki67、MMP-9值呈正相关性。 2. QGF可能调控Gas6与Axl抑制小鼠食管癌的发生与发展并且能够提高4NQO诱导小鼠的生存率。 3. QGF通过调控Gas6、Axl及相关蛋白影响食管癌细胞KYSE150迁移、侵袭和运动。并抑制裸鼠中食管癌细胞肺转移瘤的进展 4. QGF通过调控Gas6、Axl及相关蛋白抑制裸鼠中食管癌肺转移瘤的生长。 5. QGF能够调控Gas6、Axl及相关蛋白，抑制615小鼠皮下移植瘤中癌细胞脱离原发灶，抑制肺转移。 6. Gas6和Axl很可能是食管癌治疗的联合作用靶点，QGF通过调控Gas6、Axl抑制食管癌侵袭和转移，为食管癌的治疗提供新思路。
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