摘要
自噬是一种高度保守的过程，帮助细胞应对各种应激包括营养物质缺乏等。氨基酸缺失是能够有效诱导自噬发生。在自噬体形成过程中，两个类泛素化系统扮演了重要的角色。在Atg8-PE（磷脂酰肌醇）类泛素化系统中，半胱氨酸蛋白酶Atg4具有不可或缺的作用。Atg4一方面剪切Atg8使其暴露末端的甘氨酸（Atg8-I），在类泛素化酶Atg3、Atg10以及Atg5-Atg12的作用下连接PE（脂化）；另一方面Atg4解偶联Atg-PE（去脂化）既能促进Atg8-I的重复利用同时促进自噬体的成熟。这个过程高度保守，在哺乳动物中，ATG4B对微管相关蛋白1轻链3（LC3）具有高度选择性。目前有研究表明有蛋白通过调控ATG4B的活性来调控自噬，但是否参与氨基酸缺失诱导的自噬过程还不清楚。 本试验基于实验室前期的研究成果，在饥饿情况下以ATG4B为诱饵蛋白，通过串联亲和纯化技术获得ATG4B的互作蛋白，质谱鉴定分析后发现一系列蛋白。以此为基础，开展了两方面的研究： 1.PFKP介导的ATG4B磷酸化参与氨基酸缺失诱导的自噬 本研究首先通过功能缺失试验结合免疫印迹、免疫荧光以及磷脂酶D试验等发现ATG4B敲除抑制LC3B原型的剪切，从而抑制LC3-I的形成，而ATG4B过表达则过度解偶联LC3-II，均会抑制自噬发生。随后根据串联亲和纯化结合质谱数据的结果，ATG4B的一个互作蛋白即经典的代谢激酶磷酸果糖激酶1血小板型（phosphofructokinase1platelet isoform,PFKP）首先被关注。通过免疫共沉淀、GST pull-down以及免疫印迹试验发现，PFKP以氨基酸敏感的方式与ATG4B相互作用。进一步功能缺失试验发现PFKP的丢失会抑制氨基酸缺失情况下p62的降解以及自噬流的进程。接着通过磷酸化质谱鉴定、免疫共沉淀以及体外磷酸化试验等发现PFKP能够作为蛋白激酶在氨基酸缺失情况下磷酸化ATG4B的S34位。随后在野生型以及PFKP敲除细胞中进行ATG4B点突变试验、体外ATG4B活性检测等试验，结果表明PFKP介导的ATG4B的磷酸化会促进氨基酸缺失情况下p62的降解，同时提高ATG4B的活性。由于在磷酸化质谱鉴定结果中同时发现PFKP S386位的磷酸化，因此最后在PFKP敲除细胞中进行PFKP点突变、免疫共沉淀等试验发现PFKP本身在S386的磷酸化对于其调节ATG4B S34磷酸化的能力也很重要。本研究首次发现PFKP作为一个蛋白激酶磷酸化ATG4B，提高ATG4B的活性来促进氨基酸缺失诱导的自噬。 2.LRP130-SLIRP复合物对氨基酸缺失诱导自噬的影响 在ATG4B的互作蛋白存在一些线粒体相关的蛋白，首先通过ATG4B免疫共沉淀以及免疫印迹试验验证发现LRP130、SLIRP与ATG4B的相互作用受氨基酸的影响。查阅资料发现LRP130-SLIRP主要在线粒体中定位，也有可能在胞浆中定位，因此探究LRP130-SLIRP与ATG4B的相互作用发生的具体场所。通过快速亲和纯化线粒体以及免疫印迹试验发现ATG4B在线粒体中没有定位。随后WB检测梯度离心获取的粗线粒体以及胞浆发现LRP130-SLIRP可以在胞浆中定位，说明LRP130-SLIRP与ATG4B的互作可能发生在胞浆中。LRP130-SLIRP免疫共沉淀试验进一步验证LRP130-SLIRP与ATG4B的互作受氨基酸影响。接下来探讨两者的相互作用对自噬或者线粒体功能的影响。一方面通过荧光定量PCR、免疫印迹试验发现ATG4B敲除提高线粒体基因编码的mRNA以及蛋白水平。检测葡萄糖消耗、乳酸产量以及ATP产量发现ATG4B敲除会提高由线粒体氧化磷酸化产生的ATP的含量。另一方面通过RNA干扰技术、免疫荧光、免疫印迹等发现敲低LRP130与SLIRP会促进p62的降解，增加LC3的荧光点数，而过表达则结果相反，由此说明LRP130-SLIRP是自噬的负调控因子。在细胞中表达截短了不同结构域的LRP130突变体，发现截短ENTH（Epsin N-terminal homology domain）结构域后使得自噬对于氨基酸缺失不敏感。这些结果说明LRP130在氨基酸缺失诱导自噬过程中可能是ENTH结构域来发挥作用。
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