摘要
荔枝（LitchichinensisSonn.）属于无患子科荔枝属常绿乔木，是热带亚热带重要的经济树种。荔枝新品种选育以实生选种为主，近年来荔枝杂交育种育种取得快速发展，但育种周期长，当前细胞工程和基因工程等生物技术育种方法发展迅速，有望成为荔枝育种的新途径。但由于荔枝组织培养和植株再生十分困难，且遗传转化效率极低，导致荔枝生物技术育种进展缓慢。BABYBOOM和WUSCHEL是植物体细胞胚胎发生的关键调控基因，本研究筛选到其候选基因：LcBBM和LcWUS，并对其进行功能的初步分析，研究结果为促进荔枝的再生和遗传转化效率提供理论依据。主要结果如下： 1、分别以AtBBM和AtWUS为参考，在荔枝基因组数据库中筛选并克隆得到LcBBM和LcWUS基因。LcBBM和LcWUS的开放阅读框全长分别为2361bp、831bp。生物信息学分析结果显示LcBBM具有两个高度保守的AP2保守结构域，属于AP2/ERF家族；LcWUS具有一段高度保守的WUS-box结构域，属于WOX家族。系统进化树分析表明LcBBM与大豆GmBBM1、苜蓿MtBBM、木豆CcWUS聚为一个分支，亲缘关系较近；LcWUS与甜橙CsWUS的亲缘关系最近。 2、通过qRT-PCR分析LcBBM和LcWUS基因的组织特异表达及其在荔枝体细胞胚发育过程中的表达，结果表明，LcBBM在根中的表达量最高，在假种皮的表达量最低；在愈伤组织和体细胞胚发育阶段都有表达，在心形胚时期表达量较低。LcWUS在荔枝嫩叶的表达量最高，其次是根和茎段；LcWUS在愈伤组织和不同发育阶段的胚状体中均有表达，在心形胚时期的表达量最高。 3、分别构建了pC18-LcBBM和pC18-LcWUS亚细胞定位载体，通过根癌农杆菌介导烟草叶片的瞬时转化，结果显示LcBBM和LcWUS均定位在细胞核上，属于核蛋白。 4、分别构建了三种植物表达载体：pPZP6k90-LcBBM、pPZP6k90-LcWUS及pPZP6k90-LcWUS-LcBBM，通过在烟草和番茄的外植体中进行异源表达，结果证实转入LcBBM、LcWUS或LcBBM+LcWUS基因可以使烟草叶片和番茄下胚轴等外植体在不含植物激素的MS培养基上明显形成愈伤组织，并有大量不定芽生成，番茄的子叶上虽然有不定芽的形成，但再生不定芽率较低。 5、通过根癌农杆菌介导LcBBM、LcWUS或LcWUS+LcBBM在荔枝叶片中进行同源功能验证，经转化的荔枝叶片上愈伤组织诱导率和诱导量均显著提高，但未能实现再生。
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