摘要
壳寡糖与壳聚糖相比具有较好的水溶性，其聚合度较低更易被吸收利用。目前主要通过化学法，物理法和酶解法来制备壳寡糖，而酶法降解壳聚糖制备壳寡糖既符合当前国家呼吁倡导的绿色生产，也能够专一性的降解得到目的聚合度的壳寡糖，因此成为制备可控聚合度壳寡糖的主要手段之一。但目前仅对有限数量的壳聚糖酶进行了表征，海洋来源的壳聚糖酶研究较少，海洋来源的壳聚糖酶与其他来源的壳聚糖酶是否具有特异性并没有深入的研究与探讨。通过本论文希望能够为海洋壳聚糖酶提供相关资料，从而降低目前商品壳聚糖酶的价格。 本论文的主要内容如下 1.雪白链霉菌（Streptomycesniveus）海洋壳聚糖酶Sn1-CSN的表达和性质与应用研究 本论文对来源于深海沉淀物的雪白链霉菌（Streptomycesniveus）海洋壳聚糖酶Sn1-CSN在大肠杆菌中进行了表达，使用镍柱进行蛋白的纯化，利用聚丙烯凝胶电泳分析可知，Sn1-CSN基于氨基酸序列的预测分子量为29.8kDa。利用DNS法检测最适pH，pH稳定性，最适温度，热稳定性及金属离子对酶活的影响，Sn1-CSN的最适pH为6.0，在pH4-11范围内保持比较高的稳定性；最适温度为50℃；Sn1-CSN能够在45℃下保持非常好的热稳定性；Sn1-CSN在加入Cu2+后酶活性获得了显著提高，Fe3+使Sn1-CSN酶的活性受到了抑制；Sn1-Csn的表观km和kcat值分别为1.8mg/mL和88.3s-1。 通过TLC，HPLC和MS分析可知Sn1-CSN催化的壳聚糖主要水解产物（脱乙酰度，DDAgt;94%）为壳二糖，没有单糖的产生，是内切型壳聚糖酶。Sn1-Csn催化降解部分乙酰化的壳聚糖（DDA69%）的降解产物在DP2-15，组成相对比较复杂。 根据系统进化树可知Sn1-CSN与来自链霉菌属（Streptomycessp.）SirexAA-E的SACTE_5457共享同一分支。两个保守的谷氨酸（Glu40）和天冬氨酸（Asp58）残基被视为Sn1-CSN中的催化残基。由分子对接的结果可知Sn1-CSN与壳二糖的相互结合作用弱于与壳三糖的结合作用。 2.南极地衣的链霉菌（Streptomycessp.）PAMC26508海洋壳聚糖酶SPAMC-CSN的表达和性质与应用研究 本论文对来源于南极地衣的链霉菌（Streptomycessp.）PAMC26508海洋壳聚糖酶PAMC-CSN在大肠杆菌中过表达，使用镍柱进行蛋白的纯化，利用聚丙烯凝胶电泳分析可知，SPAMC-CSN基于氨基酸序列的预测分子量为29.37kDa。SPAMC-CSN的最适pH为7.0，是一种中性酶；在pH4-11范围内保持比较高的稳定性；最适温度为45℃；SPAMC-CSN能够在50℃下保持较好的热稳定性；SPAMC-CSN在加入Cu2+后酶活性获得了显著提高，Fe3+和Zn2+能抑制SPAMC-CSN的活性；SPAMC-CSN的表观km和kcat值分别为0.724mg/mL和88.3s-1。 通过TLC，HPLC和MS分析可知SPAMC-CSN催化的壳聚糖主要水解产物（脱乙酰度，DDAgt;94%）为壳二糖，壳三糖和壳四糖。而SPAMC-CSN催化降解部分乙酰化的壳聚糖（DDA69%）的降解产物在DP2-10之间。 根据系统进化树可知SPAMC-CSN与SACTE_5457和ScCsnA表现出较高的序列同一性。SPAMC-CSN的催化残基为谷氨酸（Glu40）和天冬氨酸（Asp58）残基。由分子对接的结果可知SPAMC-CSN与壳二糖的相互结合作用弱于与壳三糖的结合作用。
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